Бимолекулярные флуоресценции комплементации (BiFC) Пробирной для белок-белковые взаимодействия в Лук ячеек с использованием генной пушки Helios

Данная процедура позволяет протестировать взаимодействие белков in vivo между двумя регуляторами транскрипции Arabidopsis: SEU (сокращенно от SEUS) и LUH (сокращенно от LUHOLOG). С помощью метода биомолекулярной флуоресцентной комплементации белок SEU сливается с N-терминальным фрагментом желтого флуоресцентного белка (YFP), а LUH — с C-терминальным фрагментом YFP в двух плазмидных конструктах. SEU-NYFP и LUH-CYFP вводятся в эпидермальные клетки лука методом биолистики для проверки их взаимодействия.

Взаимодействие между Seuss и LUH вызывает ассоциацию N-концевого и C-концевого фрагментов YFP в ядрах, что приводит к возникновению флуоресценции YFP в ядрах. После инкубации в темноте в течение 16–20 часов кожуру эпидермиса лука исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа для визуализации флуоресценции. Здравствуйте, я Кортни Холландер из лаборатории доктора Zhi Lu с кафедры клеточной биологии и молекулярной генетики Мэрилендского университета.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру анализа белок-белкового взаимодействия в клетках лука с использованием генной пушки BioRad Helios. В нашей лаборатории этот метод применяется для изучения белок-белковых взаимодействий и локализации белков в растительных клетках. Приступим к работе.

Для начала данной процедуры подготовьте картриджи для генной пушки Helios, следуя протоколу JoVE по Вудсу и Зето (2008), в котором подробно описана процедура подготовки картриджей для каждого случая. 50 µg суммарной плазмидной ДНК смешивают с 12,5 mg золотых частиц и раствором PVP для BIFC в концентрации 0,5 mg/mL. Используя тот же метод подготовки картриджей, объединяют две плазмидные ДНК предполагаемых взаимодействующих белков: Seuss, слитый с N-концевой половиной YFP (сокращенно seus-NYFP), и LU Homolog, слитый с C-концевой половиной YFP (сокращенно L-U-H-C-Y-F-P).

Общее количество составляет 50 мкг на одну порцию, что позволяет получить до 50 картриджей с содержанием 1 мкг ДНК на 0,25 мг золота в каждом картридже. Каждый картридж предназначен для одного выстрела. После подготовки картриджей протестируйте их, чтобы убедиться в эффективности вылета золотых частиц.

Оберните чашку Петри квадратным кусочком парафильма. Затем установите давление гелия в диапазоне от 150 до 200 PSI и выстрелите только что изготовленными картриджами в квадрат парафильма. На парафильме будут видны слабые золотистые частицы.

При разном давлении гелия на поверхность парфюма может быть нанесено различное количество частиц золота. Однако при отсутствии значимых различий для бомбардировки следует выбирать более низкое давление. Данный тест также позволяет определить площадь поверхности, охватываемую каждым циклом облучения.

Для подготовки тканей лука снимите верхнюю шелуху с крупной желтой луковицы, используя чистую и острую бритву. Вырежьте прямоугольный участок размером два на восемь сантиметров глубиной в четыре-пять слоев. Извлеките прямоугольный фрагмент ткани лука и удалите два внешних слоя.

Разрежьте оставшиеся слои луковицы на квадратные кусочки размером примерно 1,5 см. Поместите кусочки лука в чашку Петри, в которой находятся кружки фильтровальной бумаги диаметром 3 мм. Увлажните их стерильной водой и накройте чашку Петри крышкой.

Кусочки луковицы готовы к бомбардировке. Сначала поместите картриджи в белые круглые держатели; загрузите картриджи с различными плазмидными конструкциями в разные держатели. Каждый держатель может вмещать до 12 картриджей для 12 выстрелов.

Здесь загружены три разных держателя. В первый держатель вставлены картриджи, содержащие 35 S-G-F-P-A — сильный конститутивный промотор вируса мозаики цветной капусты. Эта плазмида служит положительным контролем.

Во второй держатель устанавливают экспериментальные картриджи, содержащие равное количество S-E-U-N-Y-F-P и L-U-H-C-Y-F-P. В третий держатель устанавливают картриджи, содержащие эквимолярную смесь вектора puck spine и LUH puck spice. Это также служит отрицательным контролем.

Вставьте аккумулятор и новый вкладыш ствола в генную пушку Helios. Убедитесь, что и на вкладыше ствола, и на самой пушке установлены соответствующие уплотнительные кольца. Затем вставьте в генную пушку пустой держатель картриджа так, чтобы маркировка с номером 12 на держателе была направлена к верхней части пушки.

Передвиньте держатель картриджа один или два раза, чтобы убедиться в правильности его установки. Затем подсоедините пистолет к баллону с гелием и отрегулируйте давление в диапазоне от 150 до 200 PS. Надев средства защиты органов слуха, сделайте несколько холостых выстрелов, зажимая боковую кнопку и нажимая на спусковой крючок. Выстрелы с пустым держателем картриджа очищают камеру пистолета и обеспечивают стабильность давления.

Перед обстрелом ДНК можно использовать кусочек лука в качестве отрицательного контроля для оценки фоновой флуоресценции. Для обстрела золотых частиц, покрытых ДНК, извлеките пустой держатель картриджей и вставьте первый загруженный держатель, содержащий положительный контроль. Передвиньте держатель так, чтобы картридж, предназначенный для выстрела, находился в нижней части держателя.

Теперь поместите кусочки лука в центр пустого чашки Петри самым внутренним слоем луковицы вверх. Установите направляющую ствола генной пушки на чашку Петри и произведите выстрел. Перейдите к следующему картриджу и облучите другой кусочек лука.

Повторяйте этот шаг до тех пор, пока не будет облучено четыре-пять кусочков луковицы. Каждый кусочек луковицы облучается только один раз. Перенесите облученный кусочек луковицы в чашку Петри с увлажненной фильтровальной бумагой толщиной 3 mm для проращивания экспериментальных картриджей.

Замените картридж на Holden. Во-вторых, не забудьте заменить вкладыш ствола, чтобы предотвратить контаминацию. Проведите облучение четырех-пяти кусочков лука, как показано выше, для положительного контроля.

Затем смените картридж на Holden. Номер три, содержащий ДНК отрицательного контроля. И снова введите четыре-пять фрагментов луковицы.

Замените футеровку ствола, чтобы предотвратить загрязнение. После бомбардировки накройте крышками чашки Петри с кусочками лука.

Оберните их парафильмом, чтобы предотвратить высыхание. Инкубируйте фрагменты луковицы при комнатной температуре в темноте от 16 до 48 часов. После завершения бомбардировки перекройте подачу газа и сбросьте давление, прежде чем отсоединять генную пушку от баллона с гелием; открутите вкладыш ствола и извлеките держатель картриджей и использованные картриджи.

Наконец, очистите держатели картриджей и вкладыши цилиндров, погрузив их в стакан с мыльным раствором, и обработайте ультразвуком в течение 20 минут. После этого промойте их водой, чтобы удалить все остатки мыла.

Выдержите в 70% ethanol в течение одного часа, затем просушите на бумажных полотенцах. Приступайте к наблюдению за фрагментами лука через 16–20 часов после бомбардировки. После инкубации бомбардированных фрагментов лука в течение 16–20 часов при комнатной температуре с помощью плоских пинцетов осторожно снимите один слой клеток с внутреннего эпидермиса лука.

Этот слой непосредственно обращен к пушке во время облучения. Поместите отделенный слой в каплю воды на предметное стекло и накройте его покровным стеклом. При этом будьте осторожны, чтобы свести к минимуму образование пузырьков воздуха.

Наблюдайте за флуоресценцией GFP или YFP с помощью флуоресцентного микроскопа, такого как Zeiss Axio Observer, Point Z1, показанного здесь в режиме светлого поля. Сначала проверьте наличие цитоплазматического тока, чтобы убедиться, что клетки живы. Для этого.

Облучайте препарат светом в светлом поле в течение нескольких минут, чтобы прогреть ткань лука, а затем ищите движение плазмопластов. Цитоплазматический ток не всегда легко заметить, поэтому не расстраивайтесь, если он виден нечетко. Для флуоресцентной детекции используйте соответствующие возбуждающие и эмиссионные фильтры для GFP или YFP. Также проверьте отрицательные контроли — фрагменты лука, трансфецированные нефлуоресцентной плазмидой.

Слабые желтые сигналы могут исходить от поврежденных клеток, клеточного дебриса и тканей лука. Также проверьте положительные контроли: плазмиду, содержащую конститутивно экспрессируемый флуоресцентный репортер.

Флуоресценция GFP наблюдается в некоторых, но не во всех клетках. Пузырьки воздуха также могут создавать фоновую флуоресценцию. Видимые сигналы GFP в клетках эпидермиса лука свидетельствуют о том, что картриджи, ткани лука и процесс выстрела генной пушкой подготовлены и выполнены правильно.

Здесь представлена сильная флуоресценция, наблюдаемая при использовании положительного плазмидного контроля 35 SGFP. Сильная флуоресценция видна во всей клетке, включая ядро и цитоплазму. Изображение в светлом поле позволяет увидеть соответствующие контуры клеток и ядер.

Не каждая клетка подвергается трансформации. Флуоресцентный сигнал YFP обнаруживается в ядрах клеток лука при бомбардировке клеток лука экспериментальной комбинацией Seuss, NYFP и L-U-H-C-Y-F-P, что указывает на взаимодействие Seuss NYFP и L-U-H-C-Y-F-P in vivo. Однако эта флуоресценция, обусловленная взаимодействием, значительно слабее, чем флуоресценция, вызванная 35 SGFP в положительном контроле.

Кроме того, факторы транскрипции SEUS и LUH локализованы в ядрах. Таким образом, флуоресценция YFP наблюдается только в ядре. Более того, количество флуоресцентных клеток значительно ниже, чем в положительном контроле 35 SGFP.

Это объясняется тем, что B FFC работает только в том случае, если обе партнерные плазмиды экспрессируются в одних и тех же клетках лука. В луковых клетках, подвергнутых бомбардировке с использованием картридж-холдера номер три, содержащего смесь puck spine, вектора и L-U-H-C-Y-F-P, флуоресцентный сигнал не обнаруживается, что и ожидается для отрицательного контроля. Мы продемонстрировали вам способ бомбардировки клеток лука для анализа белок-белковых взаимодействий с использованием системы генной пушки BioRad Helios.

При выполнении данной процедуры важно не забывать об использовании надлежащего положительного и отрицательного контролей, а также учитывать, что сигнал флуоресценции при BIFC может быть более слабым, а количество флуоресцирующих клеток — меньшим. На этом все. Спасибо за внимание и удачи в ваших экспериментах.