Высокая пропускная способность дрожжей плазмиды экрана Сверхэкспрессия

Общая цель данной процедуры — трансформация клеток дрожжей библиотекой плазмидных ДНК. Для этого сначала выращивают необходимое количество дрожжевых клеток, которые затем обрабатывают ацетатом лития для придания им компетентности к трансформации ДНК.

Затем проведите трансформацию компетентных клеток e-cell, смешав их с ДНК. Заключительным этапом процедуры является селекция и анализ трансформантов. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие влияние плазмидной ДНК на фенотипы дрожжей с помощью метода споттинга дрожжей и/или микроскопии.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими протоколами, такими как стандартная трансформация дрожжей, является возможность автоматизированной трансформации большого количества различных плазмид в дрожжевые клетки. Данный протокол высокопроизводительной трансформации дрожжей рассчитан на 10 планшетов с 96 лунками, однако его масштаб может быть соответствующим образом увеличен или уменьшен. При проведении более масштабных экспериментов залогом успеха является строгая организация всех планшетов и реагентов.

Когда эксперимент будет запущен, для предотвращения путаницы в данном протоколе будет использоваться автоматический диспенсер жидкостей Biobot Rapid Plate. Для начала перенесите по 5–10 µL плазмидной ДНК из массива дрожжевой плазмидной библиотеки в каждую лунку круглых 96-луночных планшетов с плоским дном. Оставьте 96-луночные планшеты открытыми в чистом вытяжном шкафу на ночь для высыхания.

Затем инокулируйте 200 миллилитров дрожжево-пептидно-декстрозной среды или среды YPD исследуемым штаммом в конической колбе Эрленмейера объемом 500 миллилитров с перегородками; инкубируйте в течение ночи при 30 °C с перемешиванием. На следующее утро разведите культуру исследуемого штамма до OD 600 = 0.1 в двух литрах среды YPD для оптимального роста. Вырастите культуры объемом до одного литра в отдельных колбах с перегородками объемом 2,8 литра.

Инкубируйте колбы на шейкере в течение четырех-шести часов при 30 °C до достижения культурами OD 600 от 0,8 до 1,0. Когда культура дрожжей достигнет OD 600 от 0,8 до 1,0, соберите клетки путем центрифугирования. Налейте культуру в четыре одноразовых конических пробирки объемом 225 мл и центрифугируйте при 3000 RPM в течение пяти минут в настольной центрифуге.

Слейте супернатант S из каждой пробирки. Добавьте в те же пробирки дополнительный объем культуры и снова центрифугируйте, повторяя процедуру по мере необходимости до полного сбора всех клеток. Промойте каждый клеточный осадок в 50 milliliters автоклавированной дистиллированной воды и ресуспендируйте путем вортексирования.

Объедините клетки в одной конической пробирке объемом 225 мл и центрифугируйте при 3000 об/мин в течение пяти минут. После удаления супернатанта S промойте клетки в 100 мл раствора ацетата лития. Снова центрифугируйте при 3000 об/мин в течение пяти минут.

Удалите SNA и ресуспендируйте клеточный осадок в 70 миллилитрах раствора ацетата лития. Вортексируйте на высокой скорости около 30 секунд до полного ресуспендирования осадка. Инкубируйте при перемешивании при 30 °C в течение 30 минут.

Затем добавьте бета-меркаптоэтанол до концентрации 0,1 М и инкубируйте при перемешивании при 30 °C еще в течение 30 минут. После 30-минутной инкубации добавьте к клеточной смеси два миллилитра кипяченой и охлажденной ДНК спермы лосося. Перелейте клеточную смесь в автоклавируемый планшет с одной лункой, после чего удалите любой образовавшийся осадок, так как он может помешать последующему дозированию пипеткой.

С помощью биобота для быстрого дозирования перенесите по 50 µL клеточной смеси в каждую лунку четырех предварительно подготовленных 96-луночных планшетов, содержащих плазмидную ДНК; не перемешивайте. Инкубируйте планшеты при комнатной температуре в течение 30 минут без встряхивания, пока происходит инкубация клеток.

Приготовьте 200 миллилитров раствора ПЭГ, ДМСО и ацетата лития. Смешайте 160 миллилитров 50% ПЭГ 33,50, 20 миллилитров ДМСО и 20 миллилитров одного молярного ацетата лития. Важно приготовить этот раствор непосредственно перед использованием.

Добавьте по 125 µL раствора ПЭГ, лития ацетата и DMSO в каждую пробирку. Тщательно перемешайте, восемь раз аспирируя и дозируя суспензию клеток. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут без встряхивания.

Затем подвергните клетки тепловому шоку при 42 °C в течение 15 минут в сухом инкубаторе. После теплового шока не складывайте планшеты друг на друга; центрифугируйте планшеты, используя адаптеры для 96-луночных планшетов. После центрифугирования удалите раствор ПЭГ, перевернув планшеты над емкостью для отходов. Затем промокните перевернутые планшеты бумажными полотенцами.

Для удаления остатков жидкости клетки должны остаться на дне лунок. Промойте клетки, добавив по 200 µL минимальной среды в каждую лунку. Снова центрифугируйте планшеты.

Удалите супернатант, перевернув планшет над емкостью для отходов и промакнув бумажными полотенцами. Добавьте по 200 µL минимальной среды в каждую лунку с помощью быстрого распределителя планшетов и инкубируйте при 30 °C в течение двух дней без встряхивания. Через два дня на дне каждой лунки с успешно трансформированными клетками должны начать образовываться маленькие колонии.

Для подготовки к анализу споруляции сначала внесите по 200 µL минимальной среды на основе OSE в каждую лунку нового плоского 96-луночного планшета. Затем перемешайте содержимое каждой лунки планшета для трансформации, восемь раз аспирируя и дозируя клеточную суспензию с помощью быстрого дозатора для планшетов.

Внесите по 5 µL клеточной смеси с трансформационной чашки в каждую лунку планшета с раффинозой и инкубируйте при 30 °C в течение одного дня. На следующий день на дне каждой лунки должны появиться мелкие колонии.

Выполните анализ методом споттинга (нанесения капель) в вытяжном шкафу; стерилизуйте 96-пиновый репликатор или «frogger» путем обжига. Соберите колонии с помощью репликатора, затем перенесите их на чашки с селективными средами. После нанесения дайте чашкам просохнуть в вытяжном шкафу в течение 5–10 минут.

Инкубируйте планшеты при 30 °C в течение двух-трех дней. Здесь представлены репрезентативные результаты скрининга сверхэкспрессии плазмид у дрожжей для идентификации супрессоров и энхансеров токсичности TDP 43. TDP 43 — это человеческий белок, участвующий в патогенезе бокового амиотрофического склероза или болезни Лу Герига; экспрессия TDP 43 в клетках дрожжей приводит к агрегации и цитотоксичности.

На этих чашках видны колонии с интегрированной галактозо-индуцибельной плазмидой T DP 43, которые также были трансформированы плазмидами из библиотеки экспрессии ORF гена flex. Колонии здесь имеют красный цвет, так как данный штамм обладает мутацией, приводящей к накоплению красного пигмента. Чашка слева содержит глюкозу, которая подавляет экспрессию T DP 43 или плазмид гена flex.

На чашке справа содержится галактоза, которая индуцирует экспрессию TDP 43 и O Fs в плазмидах гена flex. Зеленая стрелка указывает на колонию, трансформированную плазмидой, которая подавляет токсичность TDP 43, о чем свидетельствует более быстрый рост и большая плотность колоний. Красная стрелка указывает на колонию, трансформированную плазмидой, которая усиливает токсичность TDP 43, о чем свидетельствует более медленный рост и меньшая плотность колоний.

После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как проводить трансформацию библиотеки плазмидных ДНК из клеток.