Бромдезоксиуридин (BrdU) Маркировка и последующих флуоресценции Активированный сотовый Сортировка по культуре независимой Определение растворенного органического углерода, разрушающих бактериопланктона

Микробы опосредуют разложение многочисленных растворенных органических углеродных субстратов или соединений РУУ, таких как в водных средах. Для полного понимания роли микробов в трансформации РУУ необходима одновременная идентификация их таксономии и функций. В данном видео демонстрируется процедура таксономической идентификации свободноживущих бактерий или бактериального планктона, которые трансформируют специфические пулы РУУ в водных средах.

Образцы воды, собранные из тестовой среды, обрабатывают и инкубируют с интересующим соединением и бромдезоксиуридином (BRDU), который встраивается в синтезируемую ДНК активно растущих клеток. Затем бактериальный планктон, меченный BRDU, маркируют антителами к BRDU, конъюгированными с ZI. Бактериальный планктон с высоким уровнем мечения BRDU изолируют методом сортировки клеток с помощью флуоресценции (FACS).

Затем из отсортированных клеток экстрагируют ДНК и проводят таксономическую идентификацию на основе результатов ПЦР-анализа гена 16S рРНК. Здравствуйте, меня зовут Стивен Роббинс, я из лаборатории доктора Чэня Мао с факультета биологических наук Университета Кент Стэйт. Сегодня мы с Лю продемонстрируем вам независимый от культивирования метод идентификации бактериального планктона, разлагающего растворенный органический углерод (DOC), в водных средах.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как внесение питательных веществ с последующим анализом ДНК бактериального сообщества, является то, что он позволяет сосредоточить анализ на высокоактивных бактериях, исключая покоящиеся и медленно растущие клетки. Здесь мы демонстрируем идентификацию бактериального планктона, использующего одно конкретное соединение растворенного органического углерода (DOC). Однако этот метод также может быть применен для изучения бактериального планктона, использующего другие отдельные соединения DOC или группы соединений DOC, такие как экссудаты водорослей.

Итак, возьмем образцы воды и приступим. Перед проведением анализа образцов воды на наличие бактериального планктона, разлагающего растворенный органический углерод (DOC), образцы необходимо соответствующим образом подготовить. Образцы, представленные здесь, были собраны у побережья Джорджии; из них необходимо удалить крупные частицы и ER VRE из пробы воды.

Используйте перистальтический насос для перекачки воды из приемного канистры в блок фильтрации с фильтром, имеющим размер пор 1 мкм. Затем перенесите аликвоты фильтрата объемом 36 мл в три стерильные полипропиленовые пробирки по 50 мл. Каждая пробирка должна содержать 4 мл свежеприготовленного 10% раствора параформальдегида. Инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре для фиксации клеток после инкубации.

Налейте воду в фильтрационную колонку стеклянной установки для вакуумного фильтрования с белыми мембранными фильтрами с размером пор 0,22 мкм и включите вакуум, чтобы пропустить раствор через фильтр. Промойте фильтр, пропустив через него 10 мл PBS с помощью вакуума. Маркируйте фильтры как отрицательные контроли и храните их при температуре -20 °C.

Для создания экспериментальной экосистемы или микрокосма наполните шесть предварительно промытых стеклянных колб объемом один литр 800 миллилитрами предварительно отфильтрованного образца воды. Добавьте в каждый микрокосм BRDU до конечной концентрации 10 micromolar. Быстро перемешайте содержимое, вращая колбу вручную.

Каждый образец будет проанализирован в трех повторностях. Таким образом, в три микрокосма добавьте модельное соединение DOC. В данном случае реин добавляется в микрокосмы до конечной концентрации 100 nanomolar.

Затем в остальные три микрокосма добавьте стерильный PBS. Они будут служить контролями без DOC. Поместите все микрокосмы в встряхивающий инкубатор с частотой 100 RPM в темноте при температуре, соответствующей условиям in situ, которая составляет 25 °C. Отбор проб производится в моменты времени 0, 8, 16 и 24 часа.

Соберите по 36 миллилитров из каждого микрокосма в стерильную полипропиленовую пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую четыре миллилитра свежего 10% параформальдегида; инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре для фиксации клеток. Затем профильтруйте фиксированные клетки через белые мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкм. Пропустите 10 миллилитров PBS через вакуумный фильтр, чтобы смыть остатки PFA.

Сразу переходите к иммунодетекции INS in situ или храните фильтры при температуре минус 20 градусов Цельсия для анализа включения BRDU в бактериальный планктон. Начните с обработки фильтров с образцами при комнатной температуре для разрушения клеточной стенки бактерий. Поместите фильтр в фильтрационную установку, затем пипеткой нанесите 1 мл раствора лизоцима на фильтр, чтобы покрыть клетки, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.

После инкубации создайте вакуум для удаления раствора. Когда раствор пройдет через фильтр, промойте клетки, добавив 10 milliliters PBS, и снова примените вакуум. Затем для дальнейшего разрушения клеточной стенки добавьте на фильтр one milliliter раствора протеиназы K, чтобы покрыть клетки.

Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Промойте PBS для получения однослойной ДНК. Добавьте один миллилитр раствора экзонуклеазы, чтобы покрыть клетки на фильтре.

Инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут. После инкубации промойте фильтр, пропустив 10 мл PBS через вакуумный фильтр. Затем обрежьте края фильтра, чтобы удалить часть, не содержащую клеток.

Затем на сухой поверхности, очищенной спиртом, с помощью стерильного лезвия разрежьте фильтр на восемь равных частей. Для каждого образца потребуются восемь инкубационных камер с герметичной рамкой; поместите одну восьмую часть фильтра в собранную инкубационную камеру стороной образца вверх. После сборки камер используйте набор для анализа пролиферации клеток Roche Intu для детектирования клеток, меченных BrdU, in situ.

После завершения стандартных процедур извлеките секцию фильтра из инкубационной камеры и поместите ее на стерильную поверхность; используя стерильное лезвие, разрежьте секцию фильтра на мелкие кусочки. Перенесите кусочки фильтра в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую 1 мл PBS, плотно закройте пробирку и загерметизируйте ее парафильмом. Затем инкубируйте пробирку в шейкере при 37 °C и 200 об/мин в течение 10 минут.

После инкубации плотно закройте пробирку и перемешайте ее на вортексе на максимальной скорости. В течение пяти минут перенесите супернатант в стерильную полипропиленовую пробирку объемом 15 мл. Затем ресуспендируйте фильтр в PBS и повторите этапы перемешивания на вортексе и инкубации еще дважды, каждый раз добавляя супернатант в ту же пробирку объемом 15 мл для каждого образца.

Храните ресуспендированные клетки при температуре 4 °C. Анализ образца следует провести в течение двух дней. Наконец, проведите сортировку клеток для выделения популяции с высоким уровнем включения BrdU.

В данной работе используются проточный цитометр BD FACS Aria и соответствующее программное обеспечение. После сортировки клеток обогащенную популяцию BrdU можно проанализировать для определения её таксономической принадлежности. Для амплификации генов 16S рибосомальной РНК отсортированных бактерий с помощью ПЦР на фильтре, перенесите отсортированные клетки на белый поликарбонатный мембранный фильтр с размером пор 0.22 мкм и включите вакуумный насос; затем с помощью стерильного лезвия обрежьте свободные от клеток края фильтра.

Разрежьте фильтр на четыре равных фрагмента для каждого условия; поместите один фрагмент фильтра в каждую из трех ПЦР-пробирок так, чтобы слой с клетками был обращен внутрь пробирки. Добавьте 45 µL воды для ПЦР. Убедитесь, что фрагмент фильтра полностью погружен в воду.

Затем добавьте две бусины Roche illustra pure T ready to go PCR и кратковременно перемешайте на вортексе, чтобы помочь растворению бусин. После этого добавьте по 2 µL прямого и обратного праймеров к гену 16S рибосомальной рНК.

Добавьте либо 1 µL BSA для поглощения ингибиторов амплификации, либо 1 µL воды. Проведите ПЦР-амплификацию в амплификаторе. Рекомендуется использовать программу touchdown-ПЦР, при которой температура отжига последовательно снижается с 62 до 52 °C на 1 °C за цикл, с последующими 15 циклами при 52 °C.

Подтвердите амплификацию ПЦР с помощью электрофореза на 1% агарозном геле, окрашенном бромидом этидия; вырежьте ПЦР-ампликоны из геля и очистите их с помощью набора KaiGen cayo quick gel extraction kit. После очистки ПЦР-продуктов из геля объедините ампликоны одного и того же образца. Очищенные ампликоны 16s рибосомальной ДНК теперь готовы к проведению ряда молекулярных анализов.

Образцы были собраны на прибрежном участке в Джорджии и обработаны для изучения бактерий, разлагающих рацин, согласно процедурам, описанным в данном видео. Рацин представляет собой полиаммидное соединение, которое повсеместно встречается в морской среде. Как показано здесь, он может служить источником питательных веществ и энергии для морских бактерий.

Анализ данных образцов показал, что после 24-часовой инкубации в микрокосмах с добавлением Racine развилась группа бактерий с более высоким уровнем интенсивности флуоресценции FXI, которая положительно коррелировала со степенью включения BRDU. Эти клетки были обозначены как клетки с высоким включением BRDU или HI; предполагалось, что они состоят преимущественно из бактерий, разлагающих Racine. Клетки типа hi отсутствовали.

В контрольных образцах без добавок были обнаружены клетки, содержавшие более низкие уровни включения BRDU, которые были обозначены как клетки lii; ожидалось, что они будут состоять преимущественно из бактериального планктона, не способного к использованию. Добавленные клетки Racine HI были отсортированы по отдельным пробиркам, а затем собраны на мембранные фильтры. Частичные ампликоны гена 16S рРНК были получены после ПЦР на фильтрах и подтверждены методом гель-электрофореза.

После применения сортирующего фильтра можно провести ПЦР-амплификацию функциональных генов для изучения функционального разнообразия отсортированных клеток. Мы только что продемонстрировали, как физически отделять и идентифицировать функционально активные бактериальные клетки в водной среде, используя метод, сочетающий сортировку клеток с помощью флуоресцентно-активированного клеточного сортера и включение BrDU. Помните, что BrDU токсичен, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда использовать халат и перчатки.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.