Высокая пропускная способность автоматизированной платформы для развития производства клеточных линий для белка терапии

Общая цель данной процедуры заключается в разработке производственных клеточных линий для биопрепаратов, обладающих клональностью и высокой продуктивностью. Это достигается путем трансфекции клетки-хозяина ДНК, кодирующей интересующий ген. Следующим этапом процедуры является выделение высокопродуктивных клонов, после чего осуществляется документирование образования колоний с помощью системы Clone Select Imager.

Заключительным этапом является скрининг и отбор высокопродуктивных клонов. В конечном итоге с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ можно получить результаты, демонстрирующие выработку антител в культурах с непрерывным питанием и в культурах с подпиткой. Видеодемонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы сортировки и pcan 80 dgl сложно освоить из-за сложности настройки этих процедур; следующие ученые из лаборатории продемонстрируют эти процедуры: Джейсон Сандерс — трансфекцию клеток-хозяев, сортировку и документирование формирования колоний, и Рассел Кан — отбор проб с помощью Tecan.

Для начала данной процедуры за один день до трансфекции высейте клетки-хозяева в флакон для культивирования клеток в 15 миллилитрах ростовой среды. Инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 °C и 7,5% CO2. На следующий день приготовьте трансфекционные комплексы: сначала разведите 8 мкг ДНК в 800 мкл ростовой среды без сыворотки в стерильной микроцентрифужной пробирке, аккуратно перемешав. Затем разведите 40 мкл липосомального реагента в 800 мкл ростовой среды без сыворотки в полистирольной пробирке.

Добавьте разведенную ДНК к разведенному Lipofectamine. Осторожно перемешайте и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы подготовить клетки-хозяева к трансфекции. Удалите ростовую среду из лунок с клетками и замените ее 6.4 milliliters ростовой среды без сыворотки.

Добавьте 1,6 мл трансфекционных комплексов в колбу. Осторожно перемешайте, покачивая колбу. Инкубируйте клетки при 37 °C в CO₂-инкубаторе в течение шести часов.

Через шесть часов добавьте в колбу восемь миллилитров ростовой среды и инкубируйте при 37 °C в CO2-инкубаторе в течение ночи до следующего дня. Удалите среду путем аспирации и добавьте в колбу свежую ростовую среду. После этого повторно инкубируйте клетки в течение ночи.

Замените ростовую среду на селективную среду. Инкубируйте клетки при 37 °C в инкубаторе с подачей углекислого газа в течение двух-трех недель. Через две-три недели после трансфекции клетки готовы к клонированию методом сортировки клеток с помощью проточной цитометрии; снимите клетки с поверхности колбы и центрифугируйте при 800 об/мин в течение пяти минут при 4 °C.

Ресуспендируйте клетки в селективной среде, дополненной 2% бычьим сывороточным альбумином. Затем добавьте флуоресцентно меченное антитело к IgG человека. Добавьте разведение 1:20, инкубируйте на льду от 15 до 30 минут, затем дважды промойте холодным PBS и ресуспендируйте клетки в 1 XPBS в полипропиленнй пробирке.

На данном изображении представлен пример окрашенных клеток для асептической сортировки на BD FACS Aria. Подготовьте 96-луночный планшет для культивирования клеток, содержащий по 200 µL селекционной среды в каждой лунке. В асептических условиях загрузите пробирку с клетками и проведите анализ на BD FACS Aria, зафиксировав результаты для окрашенных и неокрашенных клеток соответственно.

Настройте гейты и параметры сортировки так, чтобы одиночные клетки с нужным профилем флуоресцентного окрашивания попадали в 96-луночный планшет; инкубируйте планшет в термостате при 37 °C в течение двух недель. На нулевой, третий, седьмой и тринадцатый дни после сортировки зафиксируйте образование колоний в 96-луночном планшете с помощью системы визуализации для селекции клонов, чтобы убедиться, что клоны произошли от одной клетки, и отобрать наиболее продуктивные клоны. Сначала зафиксируйте положение образцов в приемном 96-луночном аналитическом планшете. Затем с помощью роботизированной системы дозирования жидкости перенесите аликвоты супернатанта объемом 20 µL в каждую лунку 96-луночного аналитического планшета. Анализ продукции антител в образцах проводится методом сэндвич-ИФА.

Определение человеческого IgG методом ELI SA на системе автоматического дозирования жидкостей осуществляется следующим образом. Сначала образцы и стандарт наносят на предварительно подготовленные планшеты для анализа с антителами к человеческому IgG (bio coat). Планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение двух часов, после чего проводят три промывки раствором PBS.

Затем на планшеты в разведении 1:2000 добавляют очищенные антитела козы к IgG человека, конъюгированные с HRP, и инкубируют планшеты в течение одного часа при комнатной температуре. Через час планшеты трижды промывают PBS, после чего добавляют субстрат ABTS.

Наконец, планшеты считывают на планшетном ридере, используя абсорбцию при 405 нанометрах для детекции. С помощью этой автоматизированной платформы было обнаружено, что уровень поверхностных антител, определяемый путем окрашивания флуоресцентно меченными анти-человеческими IgG, коррелирует с продуктивностью антител клетки. Как показано здесь для двух лучших клонов, полученных из популяции клеток с высокой экспрессией поверхностных антител, удельная продуктивность варьировала от 50 до 70 пикограммов на клетку в день.

Напротив, продуктивность антител составляла примерно 20 пикограмм на клетку в день для двух лучших клонов, полученных из популяции клеток с низким уровнем экспрессии поверхностных антител. Кроме того, клеточные линии, разработанные методом FACS-сортировки, более стабильны в отношении продукции антител, чем линии, полученные путем ручного лимитирующего разведения. Удельная продуктивность лучшего клона (клон один), полученного ручным лимитирующим разведением, снизилась с примерно 30 PCD до примерно 10 PCD после культивирования в течение 80 удвоений клеток.

С другой стороны, лучший субклон, полученный путем FACS-сортировки клона два, был способен поддерживать удельный выход на уровне около 20 PCD на протяжении как минимум 100 удвоений клеток. Идентификация сайта интеграции трансгена в хромосоме клетки с помощью флуоресцентной гибридизации in situ показала, что клон один представляет собой смешанную популяцию фенотипа A и фенотипа B. Напротив, отсортированный методом FACS клон оказался более гомогенной популяцией, в которой 99,5% клеток имели фенотип A. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать производственные клеточные линии для экспрессии терапевтических белков.