Автоматизированная гидрофобные взаимодействия хроматографии на колонке выбора для использования в очистки белков

Общая цель данной процедуры заключается в подборе оптимальной колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием автоматизированного метода предварительного скрининга для очистки рекомбинантного белка с помощью системы жидкостной хроматографии среднего давления BioRad DUO flow. Для этого сначала готовятся необходимые буферы и бактериальные лизаты, содержащие целевой рекомбинантный белок. Затем выполняется физическая установка, подключение трубок и подготовка системы хроматографии Duo flow к протоколу скрининга.

Затем образцы вводятся в систему, и запускается запрограммированный метод подбора колонки для гидрофобного взаимодействия (HI) для сбора фракций элюата. В завершение анализируется элюат, и на основе наблюдаемых характеристик разделения определяются оптимальная колонка HI и сорбент. В итоге можно получить результаты, указывающие на предпочтительный сорбент колонки HI для масштабируемой очистки интересующего исследователя белка методом жидкостной хроматографии среднего давления с использованием возможностей автоматизированного подбора колонок HI системы DUO flow.

Основным преимуществом данного метода перед существующими подходами, такими как последовательное проведение ручной колоночной хроматографии, является то, что автоматизация процесса снижает вариативность и обеспечивает высокую воспроизводимость результатов. Как правило, специалисты, ранее не применявшие данный метод, могут столкнуться с определенными трудностями из-за технической сложности современных систем жидкостной хроматографии, однако этот навык быстро осваивается.

После достаточной подготовки процедуру продемонстрируют Оранж Стоун и Шелли Андерсон, две студентки моей лаборатории. Для начала приготовьте по 500 миллилитров следующих буферов: 200 миллимолярный натрий-фосфатный для буфера A1, 200 миллимолярный натрий-гидрофосфатный для буфера A2 и 4,8 молярный сульфат аммония для буфера B2; в качестве буфера B1 будет использоваться деионизированная вода. Дегазируйте буферы для обеспечения оптимальных условий хроматографического разделения. Система Maximizer будет смешивать буферы A1 и A2 для получения низкосолевого фосфатного элюирующего буфера, а также буферы B1 и B2 для получения высокосолевого раствора сульфата аммония.

Стартовый буфер. Подготовьте 20 миллилитров образца для нанесения, смешав 10 миллилитров клеточного лизата, содержащего белок, который необходимо очистить, с 10 миллилитрами буфера B two. Конечная концентрация сульфата аммония в растворе образца клеточного лизата должна составлять приблизительно 2.4 моляр, что делает его примерно эквивалентным стартовому буферу.

Профильтруйте смесь буфера для лизиса через шприцевой фильтр с низким связыванием белков с размером пор 0,45 мкм, чтобы удалить из раствора твердые частицы. Держите образец на льду до момента его загрузки в систему. Физическая установка и подключение трубопроводов хроматографической системы являются одним из самых сложных аспектов данной процедуры.

Подготовьте систему дуо-потоковой хроматографии в соответствии с представленной здесь схемой. Убедитесь, что объемы буферного раствора достаточны для всего протокола и что трубки будут оставаться погруженными в жидкость. Подключите клапан загрузки образца и динамическую петлю для образца, как показано здесь, соединив петлю с входом клапана образца в позиции три.

Подготовьте восемь пар одинакового размера трубок с внешним диаметром 1/16 дюйма. Затем подключите эти пары к позициям с первой по восьмую двух клапанов выбора колонок. После включения ламп УФ-детектора и подтверждения калибровки всех детекторов подсоедините клапан разделителя потока и контроллер разделителя фракционирующего коллектора, как показано здесь.

Клапан-разделитель и контроллер разделителя сборщика фракций во второй позиции управляются отдельно от хроматографической станции. Установите процент разделения на 10%. Замените стандартный дозатор сборщика фракций во второй позиции на дозатор для микропланшетов.

Промойте петлю для образца и продуйте хроматографическую систему. Затем запустите ручной поток элюирующего буфера через систему со скоростью 1 мл/мин. Подключите колонки-ловушки High Trap HI объемом 1 мл к позициям с двух по восемь клапанов выбора колонок.

Снимите соединительный штуцер, соединяющий селекторные клапаны второй колонки. Подсоедините фитинги колонки, расположенные выше по потоку, к устройству duo flow. Пропускайте элюирующий буфер через фитинги до полного удаления воздуха и появления крупной капли буфера.

Затем снимите заглушку, присоединенную к входу колонки, и нанесите большую каплю буфера с низкой концентрацией соли на верхнюю часть колонки. После этого подсоедините колонку к верхним фитингам. Подсоедините выход колонки к нижним фитингам и трубке селекционного клапана.

Установите предел противодавления на 40 PSI. Промойте колонку пятью объемами колонки элюирующего буфера при скорости потока 1 мл/мин. Промойте колонку 10 объемами колонки стартового буфера при скорости потока 1 мл/мин.

После стабилизации показателей pH, УФ-детектирования и обратного давления вручную переключите селекторные клапаны колонок в положение один и остановите поток буфера. Чтобы ввести образец, погрузите трубку забора пробы в образец объемом 20 миллилитров. Затем переведите клапан промывки петли ввода образца в положение один, а клапан ввода образца — в режим продувки.

Запустите насос для загрузки петли пробоотборника, прокачивая образец через трубку насоса со скоростью 1 мл/мин до тех пор, пока образец не достигнет клапана загрузки образца. Переключите клапан загрузки образца из режима продувки (purge) в режим загрузки (load). Снова запустите насос для загрузки петли пробоотборника со скоростью 1 мл/мин в окне настроек программного обеспечения Biologic до тех пор, пока в динамическую петлю пробоотборника не будет затянуто 10 мл образца.

Выберите в данной таблице системные устройства, отмеченные звездочкой. Затем выберите шесть колонок HIC для анализа программы. Линейный нисходящий градиент соли и метод предварительного анализа шести колонок вручную запускают поток стартового буфера со скоростью 1 мл/мин.

Нажмите кнопку «Пуск» (start) на контроллере разделителя, чтобы начать разделение потоков EIT в соотношении от 90% до 10%. Сразу после запуска программы метода нажмите кнопку «Пуск» (start) на сенсорной панели автономного коллектора фракций для 96-луночных планшетов. Следите за дисплеем в режиме реального времени, чтобы подтвердить ожидаемые параметры запуска. Сравните кривую поглощения при 397 нм, специфичную для GFP, с кривой поглощения при 280 нм для общего белка, чтобы оценить относительное разделение и очистку при использовании различных исследуемых сред HI. Аликоты объемом от 5 до 50 µL из фракций 96-луночного планшета можно перенести в новый планшет и проанализировать на содержание специфического белка методом ELISA или вестерн-блоттинга, а также на общее содержание белка с помощью SDS-PAGE или микрофлюидной системы электрофореза Experian. Здесь представлены репрезентативные данные по проводимости градиента соли и давлению в колонке при разведочных запусках.

Изменение концентрации соли, определяемое по проценту буфера, подаваемого из линий с высокой концентрацией соли, является типичным для методики HI. По мере снижения концентрации соли белки, связанные с колонкой, элюируются; проводимость, которая соответствует наблюдаемой концентрации соли, измеряется в линии сразу после квадрупольного детектора и УФ-детектора. Смещение между графиками градиента соли и проводимости указывает на время, необходимое для перемещения буфера от входа буфера через систему к монитору проводимости.

На протяжении всего анализа давление в системе и pH остаются относительно постоянными. На данном рисунке представлены хроматограммы последовательных ознакомительных запусков колонки HI с детектированием общего белка в потоке. Определение NGFP осуществляется путем измерения поглощения света при 280 нанометрах и 397 нанометрах соответственно.

Возможно приблизительно оценить относительное содержание GFP и степень его разделения для каждого ознакомительного запуска. При сравнении двух линий на данном рисунке пробирки с культурами для фракций 10, 12, 14, 16 и 18 ознакомительного запуска феннеля FF визуализировали при обычном или флуоресцентном комнатном освещении, а также под ультрафиолетовыми лампами, рассматривая их как спереди, так и сверху, чтобы наблюдать характерный спектр эмиссии GFP; GFP четко обнаруживается во фракции 14. На обоих UV-изображениях диффузный синий цвет на левой UV-панели представляет собой свет, излучаемый УФ-лампой.

Эти данные, полученные после анализа, хорошо согласуются с результатами детектирования GFP в потоке путем измерения абсорбции элюата при 397 нанометрах, что также позволяет определить фракцию 14 как содержащую основной пик элюированного GFP. После выполнения данной процедуры могут быть применены другие методы, такие как вестерн-блоттинг, ИФА, атомно-силовая микроскопия и анализы биохимической реконституции, для получения дополнительных ответов на вопросы, касающиеся чистоты и функциональной активности очищаемого белка.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости ручного управления системой двойного потока на нескольких этапах метода. Примерами могут служить восполнение запаса буфера и внесение образца, проверка на наличие пузырьков воздуха, а также включение и выключение детекторных ламп по мере необходимости. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать систему жидкостной хроматографии для автоматического подбора оптимальных колонок и сорбентов для гидрофобного взаимодействия (HI).

Анализ данных, представленных в тексте и на постере, позволит исследователю выбрать подходящую колонку для последующего масштабирования очистки, которую также можно сочетать с другими хроматографическими методами для повышения чистоты и выхода целевого белка.