Разделение одноцепочечных ДНК двухцепочечной ДНК и РНК из экологического сообщества Вирусный Использование гидроксиапатита хроматографии

В данном видео демонстрируется процедура разделения смешанных вирусных сообществ на основе состава их нуклеиновых кислот. Это позволяет изучать таксономическое разнообразие и функциональный потенциал сложных вирусных сообществ. В данном методе разделения нуклеиновых кислот используется гидроксиапатит — кристаллическая форма фосфата кальция.

Сначала упаковывают и уравновешивают колонку с гидроксиапатитом, после чего на колонку наносят очищенные вирусные нуклеиновые кислоты; электростатическое взаимодействие между положительно заряженными ионами кальция гидроксиапатита и отрицательно заряженным фосфатным остовом различных типов нуклеиновых кислот обеспечивает их связывание с колонкой. Затем одноцепочечные ДНК/РНК и двухцепочечная ДНК последовательно элюируют с использованием фосфатного буфера различных концентраций. Полученные нуклеиновые кислоты затем подвергают обессоливанию и концентрированию для последующей визуализации, количественного определения и идентификации методом секвенирования ДНК; электрофорез в агарозном геле подтверждает, что разделение видов нуклеиновых кислот происходит с уровнем переноса менее 9%.

Таким образом, данный метод позволяет оценить разнообразие и функциональный потенциал вирусных сообществ. Здравствуйте, меня зовут Даг Фро, я научный сотрудник в лаборатории доктора Шэннон Уильямсон в институте j Craig Venture. Сегодня я продемонстрирую вам процедуру разделения одноцепочечной ДНК, двухцепочечной ДНК и РНК из образца вирусного сообщества окружающей среды.

Этот метод обладает преимуществами по сравнению с существующими методами, такими как обработка ядер, при которой мишенью является либо ДНК, либо РНК. Хроматография на гидроксиапатите позволяет захватывать все вирусное сообщество. Данный метод позволяет нам ответить на несколько вопросов в области вирусной экологии.

Например, каков общий набор генов или разнообразие вирусного сообщества? Мы впервые задумались об этом методе, когда захотели изучить все сообщества планктона Rio из Чесапикского залива, не жертвуя частью генетической сигнатуры. Растворы, необходимые для этого эксперимента, следует подготовить заранее в соответствии с инструкциями в прилагаемом письменном протоколе; они включают 0,12 молярный фосфатный буфер, 0,20 молярный фосфатный буфер, 0,40 молярный фосфатный буфер и одноммолярный раствор фосфата.

Установив значение pH 6,8 и используя гидратированный гидроксиапатит в день проведения эксперимента, уравновесьте все фосфатные буферы и гидратированный гидроксиапатит, поместив их в водяную баню при температуре 60 °C. Начните процедуру с подготовки колонки econo, которая будет использоваться для разделения вирусных нуклеиновых кислот. Прикрепите к концу колонки econo кран и убедитесь, что он закрыт.

С помощью пипетки добавьте деионизированную воду в колонку, затем наденьте колпачок на верхнюю часть колонки и несколько раз переверните ее для промывки. Слейте воду и повторите эту процедуру промывки несколько раз. Затем извлеките стопорный кран из колонки econ и подвергните его автоклавированию для стерилизации.

Кран нельзя автоклавировать, так как он расплавится. Промойте кран ионизированной водой, затем снова 70% этанолом и дайте ему высохнуть на воздухе после автоклавирования остальных компонентов. Установите кран на место и закройте его.

Затем, работая в вытяжном шкафу, добавьте 1 mL sigma coat в колонку и покройте стекло колонки, переворачивая её вращательным движением, как показано здесь. Покрытие с помощью sigma coat позволит минимизировать прилипание нуклеиновых кислот к стеклянной поверхности. В процессе разделения поверхности одного солевого стекла были покрыты.

Откройте кран и слейте содержимое в коническую пробирку. Затем, чтобы подключить колонку к циркуляционной водяной бане, закрепите её на штативе с помощью двух зажимов. Подсоедините силиконовые трубки от циркуляционной водяной бани таким образом, чтобы поток воды из бани шел снизу вверх.

Установите температуру 60 °C и запустите циркуляцию. На практике колонку и трубки следует обернуть изоляционным материалом, таким как алюминиевая фольга или пенополиэтилен для труб. Чтобы минимизировать потери тепла, этот этап здесь не показан.

Для лучшей визуализации процедуры закройте stopcock. С помощью пипетки добавьте 10 milliliters стерильной воды, свободной от РНК. Откройте stopcock и дайте воде стечь.

Затем повторите промывку согласно процедуре второй промывки. Промойте дважды 10 миллилитрами стерильного свободного от РНК 0,12 молярного фосфатного буфера, сливая жидкость после каждой промывки. Теперь колонка готова к гидроксиапатитовой хроматографии.

Убедитесь, что стопорный кран колонки с econ закрыт. Затем, используя стерильную серологическую пипетку объемом 2 мл, медленно добавьте 2 мл подготовленного ресуспендированного регидратированного гидроксиапатита на дно колонки. Закройте колонку крышкой.

Оставьте гидроксиапатит отстояться под действием силы тяжести в течение 30 минут. Этот метод требует внимания к деталям. Скорость потока через колонку с гидроксиапатитом составляет от 0,25 до 0,5 мл/мин.

Поэтому очень важно внимательно следить за колонкой, чтобы она не пересохла. По истечении 30 минут откройте кран, чтобы слить буфер в контейнер для отходов. Закройте кран и удалите прошедшую через колонку жидкость.

Смешайте нуклеиновые кислоты с 0,12 молярным фосфатным буфером до конечного объема 500 µL и инкубируйте смесь при 60 °C в течение 10 минут. Это позволит уравнять температуру нуклеиновых кислот с температурой колонки и улучшит разделение различных видов нуклеиновых кислот за счет устранения возможных вторичных структур. Используя серологическую пипетку объемом 2 мл, быстро нанесите раствор нуклеиновых кислот на гидроксиапатит, стараясь не задеть колонку.

После того как все 500 µL пройдут через колонку, на верхнюю часть колонки можно добавить небольшое количество 0,12 M фосфатного буфера, чтобы предотвратить ее высыхание. Оставьте нуклеиновые кислоты для связывания с гидроксиапатитом на 30 минут. После инкубации для связывания поместите под колонку коническую пробирку объемом 15 мл.

Затем откройте stop-кок и соберите первую пробу объемом 500 µL, содержащую одноцепочечную ДНК. Как только будет собрано 500 µL, закройте stop-кок. Далее добавьте шесть миллилитров 0,12 M фосфатного буфера к гидроксиапатиту, стараясь не беспокоить колонку.

Затем откройте stop-кран и продолжайте собирать фильтрат, содержащий одноцепочечную ДНК, в ту же пробирку объемом 15 мл, что и на предыдущем этапе. После сбора примерно 6 мл закройте stop-кран. Добавьте в пробирку один объем раствора фенол-хлороформ-изоамилового спирта, тщательно перемешайте на вортексе, затем центрифугируйте при 3 500 ×g в течение 15 минут.

После центрифугирования в пробирке образуются два слоя. Перенесите верхний водный слой, содержащий одноцепочечную ДНК, в новую пробирку объемом 15 мл и храните образец при комнатной температуре. Для элюции и очистки РНК из колонки добавьте 6 мл 0,20 молярного фосфатного буфера и соберите фильтрат в новую пробирку объемом 15 мл. Затем проведите экстракцию фенол-хлороформом.

Что касается образца одноцепочечной ДНК, повторите этот процесс, используя 6 мл 0,40 М фосфатного буфера для элюции и очистки двухцепочечной ДНК из колонки. Наконец, чтобы полностью удалить из колонки остатки двухцепочечной ДНК, повторите этот процесс еще один раз.

На этот раз используйте 6 мл 1,00 М фосфатного буфера для обессоливания образцов нуклеиновых кислот. Перенесите от 4 до 5 мл каждого образца в центрифужный фильтр Ultra-4 с поровым пределом 30 000 Да. Концентрируйте образец до объема менее 500 µL, центрифугируя при 6 000 ×g и 30 °C в течение примерно 5 минут в роторе с фиксированным углом. После удаления фильтрата добавьте оставшуюся часть образцов в фильтр.

Доведите объем до 4–5 мл с помощью RNAs-free 1X TE-буфера. Затем снова центрифугируйте до достижения концентрированного объема. Примерно через пять минут после центрифугирования добавьте 4–5 мл RNAs-free 1X TE-буфера на фильтр и сконцентрируйте.

Повторите данную промывку еще пять раз, чтобы полностью обессолить образцы нуклеиновых кислот. После полного концентрирования и обессоливания перенесите оставшиеся образцы нуклеиновых кислот в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 миллилитра. Осадите нуклеиновые кислоты, добавив 1/10 объема ацетата натрия, два объема 100% этанола и один микролит GlycoBlue, тщательно перемешав содержимое с помощью вортекса и центрифугирования.

Центрифугирование при 28 000 g при температуре 4 °C в течение 60 минут. При этом важно не потревожить осадок.

Добавьте 300 µL 70% этанола, центрифугируйте при 28 000 g при комнатной температуре в течение 10 минут, затем аккуратно высушите и ресуспендируйте каждую фракцию в соответствующем объеме буфера TE для РНК. Равные концентрации вирусных нуклеиновых кислот: одноцепочечной ДНК M13 MP18, одноцепочечной РНК MS2, двухцепочечной РНК F16 и двухцепочечной ДНК lambda были объединены, а затем разделены с помощью гидроксиапатитовой хроматографии, как показано в этом видео. Равные концентрации одноцепочечной ДНК M13 MP18, одноцепочечной РНК MS2, двухцепочечной РНК F16 и двухцепочечной ДНК Lambda были объединены, как показано в дорожке 6, и нанесены на гидроксиапатитовую колонку, что видно здесь.

Одноцепочечные ДНК-РНК и двухцепочечная ДНК были независимо элюированы из колонки с гидроксиапатитом с использованием фосфатного буфера с молярностью 0,12 M, 0,18 M, 0,40 M и 1,00 M. Для подтверждения размеров генома использовался маркер 1 KB. Эти результаты показывают, что данный метод может быть успешно применен для разделения одноцепочечной ДНК, двухцепочечной ДНК и РНК с переносом менее 9% из одной фракции в следующую.

Этот метод также использовался для разделения нуклеиновых кислот, выделенных из вирусного сообщества Чесапикского залива, как показано здесь. Одноцепочечные ДНК/РНК и двухцепочечная ДНК элюировались независимо с использованием фосфатного буфера с концентрациями 0,12 M, 0,20 M и 0,40 M или 1,00 M соответственно. Маркер высокого молекулярного веса ДНК в первой дорожке и маркер 1 KB во второй дорожке использовались для визуального подтверждения приблизительного молекулярного веса и массы нуклеиновых кислот; как видно здесь, двухцепочечная ДНК была доминирующим типом нуклеиновых кислот, выделенных из вирусного планктона Чесапикского залива. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как разделять нуклеиновые кислоты из смешанного вирусного сообщества с помощью гидроксиапатитовой хроматографии.

Данный процесс включает подготовку колонки с гидроксиапатитом и нуклеиновых кислот, разделение и элюцию нуклеиновых кислот с использованием фосфатного буфера различных концентраций и обессоливание, а также концентрирование нуклеиновых кислот после разделения.