Количественный и анализ формирования HO-эндонуклеаза Вынужденное Хромосомные транслокации по однонитевые Отжиг в Saccharomyces CEREVISIAE

Общая цель данной процедуры — определить генетический контроль формирования транслокаций посредством одноцепочечного отжига в диплоидных клетках почкующихся дрожжей. Для этого сначала в культуры инокулируют одиночные колонии специфического генотипа и выращивают их в течение ночи. Вторым этапом процедуры является индукция одновременного образования двухцепочечных разрывов в двух хромосомах с помощью эндонуклеазы ho путем добавления галактозы в культуры.

Следующие разведения этих культур высевают на селективные и неселективные среды. Заключительным этапом является определение частоты транслокации путем подсчета колоний, выросших на селективных и неселективных средах. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие генетический контроль формирования транслокации одноцепочечным изгибом, анализируя изменения частоты стимулированного формирования транслокации в штаммах с разными генотипами.

Значимость данной методики распространяется на изучение последствий терапевтического облучения пациентов с раком, поскольку разрывы двухцепочечных ДНК и образование транслокаций являются основными последствиями такого лечения. Для начала процедуры определения частоты стимулированных транслокаций ho инокулируйте 10–20 независимых культур по 1 мл в среде YPD с глицерином и лактатом, используя одиночные колонии желаемого генотипа; инкубируйте культуры в течение ночи при 30 °C на ротаторе. Когда культуры достигнут требуемой плотности клеток, добавьте в них 20% галактозу до конечной концентрации 2%. Галактоза индуцирует экспрессию эндонуклеазы ho, которая вызывает двухцепочечные разрывы в аллеле history delta five prim на хромосоме 3 и аллеле has three delta three prim на хромосоме 15; инкубируйте в течение четырех часов при 30 °C на ротаторе.

Следующий этап имеет решающее значение для успеха процедуры. Крайне важно тщательно развести культуры и высеять их на чашки. Чтобы получить воспроизводимые показатели частоты транслокации, позволяющие провести статистически значимые сравнения между штаммами с разным генотипом, через четыре часа высейте соответствующие разведения культур на среду без гистидина, а также на YPD, чтобы на каждой чашке получилось примерно от 100 до 200 колоний. Инкубируйте чашки при 30 °C в течение двух-трех дней.

При появлении колоний можно определить частоту транслокации. Эффективность посева до и после индуцирования экспрессии эндонуклеазы ho позволит установить, влияет ли наличие или отсутствие любой из транслокационных хромосом на способность выживать при образовании двухцепочечных разрывов (DSB). Фрагментируют одну копию как третьей, так и 15-й хромосомы для определения эффективности посева до индукции.

Сначала отберите аликвоту клеток из каждой ночной культуры и определите количество клеток, используя гемоцитометр. Затем, используя подходящее разведение, высейте примерно 100–200 клеток на среду YPD и инкубируйте в течение двух-трех дней при 30 °C до появления колоний. В оставшиеся культуры добавьте 20% галактозу до конечной концентрации 2% и инкубируйте при 30 °C в течение четырех часов, чтобы определить эффективность высева после индукции.

Через четыре часа после индукции отберите аликвоту клеток из каждой культуры и определите количество клеток с помощью гемоцитометра. Высейте примерно 100–200 клеток на среду YPD, используя соответствующее разведение; инкубируйте в течение двух-трех дней при 30 °C до появления колоний. После появления колоний на чашках можно определить эффективность посева. Предполагаемые клоны с транслокацией можно исследовать с помощью саузерн-блоттинга.

В данной процедуре используется геномная ДНК, выделенная из одной рекомбинантной колонии hiss из каждого независимого опыта. Примерно 4 µg каждого образца ДНК подвергают рестрикции с помощью рестриктационной эндонуклеазы BamHI. Фрагменты после рестрикции BamHI разделяют методом электрофореза в 0,7% агарозном геле, после чего переносят на положительно заряженную нейлоновую мембрану и гибридизуют с зондом, меченным P 32, который получен путем случайного праймирования геномного клона BamHI размером 1,8 kb, содержащего ген HIS3. Визуализацию фрагментов ДНК осуществляют с помощью авторадиографии или фосфоримаджинга. Другим способом анализа клонов с предполагаемыми транслокациями является анализ хромосомных карт.

Сначала подготавливают хромосомы из выбранных рекомбинантов hiss плюс в блоках aros, разделяя хромосомы на 1% геле aros в контурном зажимном гомогенном электрическом поле (CHEF) при температуре 14 °C. Используются следующие параметры: первый блок — 14 °C, время переключения 72 с и 15 часов при 6 В/см; второй блок — 14 °C, время переключения 122 с и 11 часов при 6 В/см. По завершении электрофореза хромосомы визуализируют путем окрашивания геля бромидом AUM в течение 30 минут с последующим облучением УФ-светом и обесцвечиванием в дистиллированной воде, после чего хромосомы переносят на положительно заряженную мембрану методом капиллярного переноса.

В денатурирующих условиях проводят гибридизацию с зондом, меченным P 32 и полученным путем случайного праймирования геномного клона bam H one bam H one размером 1,8 килобазы, содержащего ген hiss. Three. Визуализируют хромосомы с помощью авторадиографии или фосфоримаджинга. Частоту хромосомных транслокаций можно рассчитать, разделив количество гистаминовых фототрофных колоний на общее количество жизнеспособных клеток, определенное путем посева на YPD.

В данном примере расчетная частота рекомбинации составляет около 3%. Анализ частоты транслокаций, стимулируемых ho, можно проводить с использованием штаммов с различными генотипами для сравнения различий в способности восстанавливать двухцепочечные разрывы путем отжига одноцепочечных участков, как показано на данном репрезентативном графике. Частоты транслокаций, полученные как селективным, так и неселективным методами с использованием гомозиготы RAD 51 delta null, статистически отличались от показателей, полученных при соответствующих условиях со штаммом дикого типа, как до, так и после посева с индукцией.

Эффективность определяют путем деления общего количества жизнеспособных колониеобразующих клеток на общее количество тел клеток в культуре, определенное с помощью подсчета в гемоцитометре, как показано в этой таблице для посева до и после индукции. Эффективность не имела значимых различий для клеток дикого типа, что свидетельствует о том, что наличие или отсутствие любой из транслокационных хромосом не влияет на способность к выживанию. Образование DSB.

Предположительные клоны, несущие транслокацию, могут быть исследованы с помощью геномного Саузерн-блоттинга. Здесь представлено графическое изображение соответствующих хромосом до и после образования транслокации. Размеры рестрикционных фрагментов, содержащих соответствующие последовательности, полученных путем переваривания геномной ДНК родительских и рекомбинантных штаммов ферментом BAM H one и выявленных на блотах путем гибридизации с 1.8 килобазовым BAM H one.

Три геномных клона His3 представлены в килобазовых парах для проведения саузерн-блот анализа. Геномную ДНК переваривают эндонуклеазой BmHI и гибридизируют с меченой ³²P зондом His3 длиной 1,8 килобазы для визуализации этих диагностических фрагментов.

Фрагменты HIS3Δ20 размером 0,8 килобазы, HIS3Δ3' размером 1,7 килобазы, T315 размером 4 килобазы, T153 размером 5 килобаз и HIS3Δ5' размером 8 килобаз. Дорожка A — родительский диплоид. Дорожка B — рекомбинант с нереципрокной транслокацией his+, и дорожка C — реципрокная транслокация his+.

Рекомбинантный хромосомный анализ BLO также может быть использован для исследования клонов с транслокациями. Целые хромосомы, подготовленные в agarose plugs, разделяют методом электрофореза в пульсирующем поле, затем гель окрашивают этидиумбромидом и визуализируют под УФ-светом. Разделенные хромосомы затем переносят на нейлоновую мембрану (блоттинг) и гибридизируют с P 32 меченным фрагментом размером 1.8 kb.

Три зонда для визуализации неповрежденной хромосомы 1.1 Mbp, хромосомы с транслокацией T 15 15.8 Mbp, хромосомы с транслокацией T 3 15 0.6 Mbp и неповрежденной хромосомы 3 0.3 Mbp. Дорожка A — родительский штамм. Дорожка B — рекомбинант с нереципрокной транслокацией his+. Дорожка C — рекомбинант с реципрокной транслокацией his+.

После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать, как определить частоту образования транслокаций после множественных двухцепочечных разрывов, индуцированных Ho.