Одно отображение Судьба сотового у рыбок данио
5 октября 2011 г.
Метод описан в photoactivate одной клетки, содержащие в клетках флуоресцентного белка с помощью двух-фотонного поглощения от Ti: Sapphire фемтосекундного лазерного генератора. Для судьба карте фотоактивированного клетки, иммуногистохимии используется. Эта техника может быть применена к любому типу клеток.
Общая цель следующего эксперимента — картирование судьбы и отслеживание линий выбранных одиночных клеток в эмбрионах zebrafish. Это достигается путем химического конъюгирования заблокированного флуоресцеина с высокомолекулярным декстраном. Затем подготовленный декстран с заблокированным флуоресцеином микроинъецируется в эмбрионы zebrafish, после чего в выбранных клетках проводится фотоактивация с использованием двухфотонного поглощения.
После фотоактивации эмбрионов проводят иммуногистохимический анализ для обнаружения высвобожденного флуоресцеинового декстрана с целью картирования судьбы активированных клеток. В конечном итоге этот метод позволяет определить вклад в клеточную линию и тканевую локализацию фотоактивированных одиночных клеток. Главным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как стандартная флуоресцентная микроскопия, является возможность дифференциальной маркировки одиночных клеток для картирования их судьбы.
Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологии развития, например, о том, как недифференцированные клетки-предшественники могут формировать различные типы тканей. Визуальная демонстрация имеет решающее значение, так как этапы закрепления эмбрионов и фотоактивации трудно освоить только на основе текстового описания. Перед началом работы синтезируйте клетко-заблокированный флуоресцеиновый декстран и храните его в пробирках, обернутых металлической фольгой. Затем проведите микроинъекции синтезированного клетко-заблокированного флуоресцеинового декстрана в эмбрионы на стадии одной-двух клеток.
После того как эмбрионы достигнут соответствующей стадии развития, нанесите на них покрытие. Затем поместите покрытые эмбрионы в низкоплавкий агар для фотоактивации. Когда агар затвердеет, запустите программное обеспечение LSM 510.
Поместите прозрачный желтый фильтр на пути пучка белого света, затем выберите «scan new image» и нажмите «start expert mode». Перейдите на вкладку лазера, включите аргоновый и Mi.Tai лазерные источники. Установите длину волны Mi.Tai на 740 nm.
Затем выберите вкладку config. Настройте конфигурации оптического пути для иона аргона и лазера mi tai. После этого выберите вкладку scan.
Установите объектив с увеличением 20x 0.8. Настройте максимальную скорость сканирования, выбрав в методе режима установки максимума (max set mode method) значения line mean и one соответственно. На вкладке каналов (channels tab) снимите выделение со всех источников лазерного излучения, кроме mi tai. Затем поместите измеритель мощности на пути оптического луча и нажмите кнопку con для активации непрерывного сканирования.
Отрегулируйте процент пропускания до тех пор, пока измеритель мощности не покажет среднюю мощность лазера 47 milliwatts. Затем остановите сканирование, нажав кнопку stop во вкладке channels. Снимите выделение с источника mi tai laser и выберите argonne iron.
Затем снова выберите кнопку fast XY на вкладке channels, настройте диафрагму (pinhole), усиление детектора (detect gain), amplify a offset и снова amplify для аргонового лазера, чтобы добиться наилучшего качества изображения. С помощью контроллера предметного столика найдите и сфокусируйтесь на клетке, которую необходимо активировать, затем нажмите кнопку stop. Используя инструмент обрезки (crop tool), обрежьте изображение активированной клетки так, чтобы коэффициент обрезки (crop factor) на вкладке mode составлял от 50 до 70.
Затем остановите сканирование, нажав кнопку остановки на вкладке «Channels» (Каналы). Снимите выделение с аргонового ионного лазера и выберите лазер My Tai на вкладке «Mode» (Режим). Установите скорость сканирования на 31.46 seconds.
Затем нажмите кнопку single, чтобы запустить сканирование для двухфотонной активации клетки с заблокированным флуоресцеиновым декстраном. После активации перейдите на вкладку channels, снимите выделение с лазера mi tai и снова выберите аргоновый ионный лазер. Затем в разделе mode установите коэффициент увеличения (zoom factor) на единицу. Далее.
В разделе speed нажмите кнопку max, чтобы установить максимальную скорость сканирования. Для просмотра области фотоактивации выберите fast xy. Затем перейдите на вкладку channels, отрегулируйте диафрагму (pinhole) и повторно выполните детектирование, чтобы убедиться в отсутствии лазерной абляции в области фотоактивации.
После подготовки фотоактивируемых эмбрионов для иммунодетекции флуоресцеинового декстрана с использованием метода «расклетки» (uncaging) в соответствии с протоколом, изложенным в прилагаемой рукописи, промойте эмбрионы шесть раз в PBT и два раза в буфере AP. Затем перенесите эмбрионы в девятилуночные планшеты с буфером AP.
Затем аспирируйте буфер AP и добавьте N-B-T-B-C-I-P. Остановите развитие окрашивания N-B-T-B-C-I-P путем аспирации раствора N-B-T-B-C-I-P. После этого промойте эмбрионы в PBT.
Теперь извлеките эмбрионы и перемешивайте их на ротационной платформе в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем повторите промывку в PBT еще два раза. В завершение поместите эмбрионы в 0,6% низкоплавящий агар и получите изображения фотоактивированных клеток с помощью вертикального светового микроскопа.
На данном рисунке представлены изображение в светлом поле (слева) и флуоресцентное изображение (справа) эмбриона данио-рерио с микроинъецированной цепью «заклеточного» флуоресцеинового декстрана до фотоактивации. Как показано здесь, фотоактивация эмбриона была проведена в одном из сомитов, отмеченном стрелкой на изображении в светлом поле слева, при длине волны 740 нм, времени сканирования 31 с и средней мощности лазера 47 мВт. На рисунке справа можно наблюдать флуоресценцию высвобожденного флуоресцеинового декстрана после фотоактивации.
Иммуноокрашивание несвязанного флуоресцеинового декстрана показано на небольшом участке боковой пластинки мезодермы эмбриона на стадии 10 сомитов. Фотоактивация проводилась с использованием тех же параметров лазера, что и на предыдущем рисунке, с последующим применением процедуры иммунодетекции. Активированная область, отмеченная здесь стрелкой, может быть идентифицирована с минимальным фоновым окрашиванием после выполнения данной процедуры.
Для более точной характеристики локализации и судьбы меченых клеток может быть проведен дополнительный анализ, например, иммуноокрашивание на различные тканеспецифические маркеры. Использование этого метода открывает перед исследователями в области биологии сосудов возможности по изучению происхождения артериальных и венозных клеток-предшественников в развивающихся эмбрионах zebrafish. Не забывайте, что при работе с такими химическими реагентами, как NBT и BCIP, которые могут быть крайне опасны, необходимо всегда использовать перчатки.
Обзор
В данной статье описывается метод фотоактивации одиночных клеток в эмбрионах zebrafish с использованием двухфотонного поглощения. Данный метод позволяет осуществлять картирование судьбы активированных клеток с помощью иммуногистохимии и применим к различным типам клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Клеточная биология
- Биология развития
Теоретические основы
- Картирование судьбы и прослеживание клеточных линий имеют решающее значение для понимания процессов развития.
- «Клетчатые» (caged) флуоресцентные белки позволяют осуществлять направленную активацию специфических клеток.
- Двухфотонное поглощение обеспечивает точный метод фотоактивации.
- Данный метод позволяет дифференцировать отдельные клетки для детального анализа.
Цель исследования
- Разработать метод отслеживания клеточных линий в эмбрионах zebrafish.
- Углубить понимание вклада клеток-предшественников в формирование различных типов тканей.
- Обеспечить визуальную демонстрацию сложных процедур.
Используемые методы
- Синтез caged-флуоресцеинового декстрана для микроинъекций.
- Фотоактивация инъецированных эмбрионов с помощью Ti:Sapphire-лазера.
- Иммуногистохимический анализ для обнаружения uncaged-флуоресцеинового декстрана.
- Получение изображений с использованием вертикального сложного микроскопа.
Основные результаты
- Успешная фотоактивация отдельных клеток в эмбрионах данио-рерио.
- Визуальное подтверждение прослеживания клеточных линий с помощью флуоресцентной визуализации.
- Демонстрация минимального фонового окрашивания при иммунодетекции.
- Возможность дальнейшего анализа с использованием тканеспецифических маркеров.
Выводы
- Данный метод способствует развитию исследований в области биологии сосудов и вопросов развития.
- Он позволяет детально изучить клеточную линию и локализацию тканей.
- При работе с химическими реагентами необходимо строго соблюдать меры предосторожности.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Картирование судьбы отдельных клеток у zebrafish с использованием двухфотонной фотоактивации и иммуногистохимии позволяет точно отслеживать линии недифференцированных клеток-предшественников. Эта возможность имеет решающее значение для снижения рисков при проверке гипотез на ранних этапах исследований и уточнения путей развития, имеющих значение для гематопоэтической и сосудистой биологии. Данный метод обеспечивает прогностическую достоверность в ключевые моменты принятия решений по портфелю проектов на стадии первичного поиска.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет проверять гипотезы о линиях развития с разрешением на уровне отдельных клеток.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем картирования вклада клеток-предшественников в формирование конкретных тканей.
- Способствует механистическому снижению рисков при изучении путей-кандидатов в системах, релевантных для заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов фенотипического скрининга.
- Обеспечение воспроизводимого количественного мечения единичных клеток для стандартизации анализа.
- Возможность надежной оценки lineage-специфических эффектов при скрининге соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает согласованность отслеживания линий развития с поиском трансляционных биомаркеров в сосудистых и гемопоэтических моделях.
- Обеспечивает преемственность от этапа первоначального поиска до доклинической валидации судьбы клеток и их локализации в тканях.
- Снижает биологическую неопределенность при принятии решений о продвижении проекта с учетом рисков.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в непрерывный процесс поиска — от раннего тестирования гипотез до идентификации ведущих соединений и валидации на доклинических моделях.
- Фундаментальная биология: способствует проверке нулевой гипотезы и уточнению путей развития за счет обеспечения точного картирования судьбы отдельных клеток.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимое маркирование отдельных клеток, готовое к использованию в последующих рабочих процессах.
- Аналитика: позволяет получать количественные данные с пространственным разрешением для сравнительного анализа вклада различных линий клеток.
- Трансляционные исследования: связывает фундаментальные открытия с доклиническими исследованиями путем сопоставления данных о судьбе клеток с биомаркерами, значимыми для конкретных заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: предоставляет универсальный, независимый от модели инструментарий для отслеживания линий в различных биологических системах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизирует маркировку и детекцию единичных клеток для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет раннего выяснения родовых связей.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию и продвижение активов на стадии поиска с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуются навыки микроинъекций, двухфотонной микроскопии и иммуногистохимии.
- Зависит от наличия конфокальных микроскопов с фемтосекундным лазером и соответствующей инфраструктуры для визуализации.
- Необходима стандартизация протоколов фотоактивации и детекции между исследовательскими группами.
- Метод может быть адаптирован для других модельных систем при надлежащей оптимизации этапов маркировки и детекции.
- Фотоэффективность и чувствительность детекции могут ограничивать возможность долгосрочного отслеживания в некоторых случаях.
