Бластомеров эксплантов для тестирования для сотовых приверженности судьбы во время эмбрионального развития

Метод, показанный в данном видео, использует карты развития эмбриона Opus на стадии дробления для идентификации отдельных бластомеров, которые затем культивируются изолированно, чтобы определить, обусловлена ли судьба эмбриона внутренними или внешними инструкциями. Сначала собирают двухклеточные эмбрионы, в которых первая борозда дробления пересекает светлопигментированную область анимального полушария. Эти эмбрионы культивируют; когда они достигают стадии 16–32 клеток, вителлярную мембрану удаляют, а соседние клетки отделяют от выбранной клетки. Для эксплантации отделенный бластомер затем переносят в углубление культуральной лунки с агаровым покрытием и культивируют.

Когда эксплантат достигает нужной стадии развития, его собирают для оценки экспрессии генов или белков с помощью гибридизации in situ, количественной ПЦР или иммуногистохимии. Основным преимуществом данного метода перед другими, такими как культивирование больших групп эмбриональных клеток или органов на подложке, является то, что отдельные эмбриональные предшественники, чья судьба развития известна из исследований по отслеживанию клеточных линий, могут культивироваться без добавления факторов роста или присутствия соседних клеток. Таким образом, можно напрямую проверить, определяют ли внутренние факторы клетки превращение данного предшественника в предшественника конкретной ткани или же для этого требуются сигналы от окружающих клеток.

Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, так как препарирование бластомеров и их перенос в лунки для культивирования требуют деликатных манипуляций под стереомикроскопом. В этом видео я использую данный метод, чтобы продемонстрировать, смещают ли полученные от матери мРНК дифференцировку клеток в сторону нейральной судьбы. Работая под диссекционным микроскопом, заточите четыре набора пинцетов с помощью абразивной пленки Illumina.

Одна пара пинцетов служит запасной на случай повреждения кончика во время процедуры; автоклавируйте все четыре пинцета и храните их в стерильном контейнере. Приготовьте по 500 миллилитров модифицированного раствора Барта (MBS) в концентрациях 0,1х и 1,0х, затем подвергните их фильтрующей стерилизации. Храните эти растворы в стеклянных бутылях с завинчивающимися крышками при температуре от 14 до 18 градусов Цельсия в течение нескольких месяцев. Приготовьте 2% agarose электрофоретического качества в 100 миллилитрах культуральной среды 1х. Автоклавируйте для растворения agarose; при последующем использовании разогрейте в микроволновой печи для разжижения agarose, пока он находится в жидком состоянии.

Налейте примерно 0.5 milliliters на дно каждой лунки стерильного 24-луночного культурального планшета. Это предотвратит прилипание имплантатов к пластику. Затем налейте примерно от двух до трех milliliters на дно двух чашек Петри диаметром 360 millimeter и осторожно перемешайте круговыми движениями для равномерного распределения.

Они будут служить чашками для диссекции, а агар предотвратит прилипание эмбрионов к пластику. После удаления мембран, когда агар остынет и затвердеет, прогрейте кончик пастуральной пипетки длиной шесть дюймов над пламенем, пока он не расплавится в шарик. Снова прогрейте шарик в течение короткого времени, затем слегка коснитесь им поверхности агара в лунке культуральной пластины.

Это создаст небольшое углубление, в которое будет помещен X explan. Повторите процедуру для каждой лунки планшета. Затем наполните каждую лунку культурального планшета одним миллилитром стерильной культуральной среды 1x.

Затем наполните чашку для диссекции 0,1 XMBS, чтобы облегчить отделение бластеров. После подготовки чашек для диссекции перенесите оплодотворенные яйца с удаленным желеобразным слоем в чашки Петри диаметром 100 мм, содержащие 0,5 x культуральной среды. Яйца, которые не будут использованы немедленно, можно культивировать при 14 °C, пока проводится поиск двухклеточных эмбрионов в первой чашке.

Осмотрите эмбрионы в первой чашке Петри с помощью диссекционного микроскопа; используя пластическую переносную пипетку, перенесите примерно 10 одноклеточных и двухклеточных эмбрионов в отдельную чашку, заполненную 0,5-кратной культуральной средой. Поместите чашку Петри в инкубатор при температуре 14 °C. Способность данного анализа точно оценивать потенциал развития клетки зависит от правильного выделения бластомера на основе карт развития.

Следовательно, крайне важно выбирать эмбрионы с правильным рисунком пигментации на стадии двух клеток, которые в дальнейшем будут соответствовать закономерностям нормального дробления. Как показано здесь, нормальное дробление часто происходит только с одной стороны эмбриона.

Эти эмбрионы все еще могут быть использованы в качестве доноров, если донорская клетка находится на обычной стороне. Когда эмбрионы достигнут стадии двух клеток, отберите те, в которых первая борозда деления пересекает слабопигментированную область в анимальном полушарии, и поместите их в отдельную чашку; отберите примерно в пять раз больше эмбрионов, чем планируется подвергнуть диссекции. Они будут служить донорами для эксплантата.

Держите оставшиеся два эмбриона двухклеточной стадии в отдельной чашке рядом с донорскими эмбрионами на протяжении всей процедуры, чтобы они служили сиблинг-контролем для определения стадии развития эксплантата. После сортировки и препарирования эмбрионов вернитесь к чашкам в инкубаторе, чтобы найти дополнительные одноклеточные и двухклеточные эмбрионы. Поскольку одноклеточным эмбрионам требуется около 90 минут для деления, это можно сделать в течение двух часов после сбора яйцеклеток.

Для подготовки экспланта поместите от пяти до 10 эмбрионов в чашку для диссекции. Затем расположите первый эмбрион так, чтобы прозрачную вителлярную мембрану можно было захватить пинцетом. Обычно она не видна, но ее можно захватить у анимального полюса, где она отделена четким периферическим пространством над поверхностью эмбриона.

Захватите остроконечным пинцетом в одной руке область на некотором расстоянии от бластера, который предстоит препарировать, чтобы избежать его повреждения. Затем остроконечным пинцетом в другой руке захватите мембрану рядом с кончиком первого пинцета и осторожно потяните в противоположные стороны, чтобы отслоить мембрану. После удаления мембраны эмбрион расправится.

Затем захватите соседнюю клетку пинцетом и используйте ее в качестве «рукоятки», чтобы клетка, подлежащая диссекции, не подвергалась прямому воздействию пинцета в другой руке; осторожно оттяните остальные соседние клетки от нужного бластомера. Если целью являются клетки срединной линии с одинаковой судьбой, их можно удалить вместе, парой. В завершение удалите клетку-рукоятку.

Захватите пару бластомеров или амниоцитов стерильной стеклянной пастеровской пипеткой, избегая образования пузырьков воздуха и избыточного всасывания. Поместите кончик пастеровской пипетки под поверхность культуральной среды в лунке чашки для экспланта X и осторожно выпустите бластомер. Он должен переместиться в неглубокое углубление под действием силы тяжести.

Бластеры от нескольких эмбрионов можно объединить в один эксплант, поместив их в одно и то же углубление в культуре. Повторяйте эту процедуру с остальными эмбрионами в чашке для диссекции по одному. Примерно через 10 эмбрионов чашка для диссекции заполнится клеточным дебрисом.

Когда это произойдет, перейдите к следующей чашке для диссекции. После завершения всех диссекций проверьте, находятся ли экспланты в неглубоких углублениях. Если нет, их можно аккуратно переместить в углубление с помощью волосяной петли, стерилизованной в 70%Ethanol и высушенной на воздухе; имплантаты следует инкубировать при комнатной температуре на лабораторном столе примерно один час после последней диссекции.

Удалите остатки тканей вокруг зажившего экспланта с помощью стерильной стеклянной пастеревской пипетки. Поместите планшет с эксплантом при температуре от 14 до 20 °C рядом с чашкой Петри, содержащей контрольные эмбрионы того же помета. Эмбрионы-сиблинги будут служить индикатором стадии развития бластемы экспланта.

Примерно через один-два часа культивирования эксплантированные бластомеры разделятся примерно четыре раза и сбросят большую часть клеточного детрита, оставшегося от поврежденных соседних клеток. Через 20 часов они образуют небольшие плотные клеточные агрегаты. Когда образцы достигнут нужной стадии развития, соберите эксплантат.

Эти экспланты сохраняются достаточно хорошо, даже если некоторые клетки подвергаются дезинтеграции. Поэтому, если в культуре наблюдается мутная масса, ее следует исследовать с помощью игольчатой петли или пинцета, чтобы определить, нет ли внутри здорового экспланта. Перенесите эксплант в небольшом объеме культурального раствора с помощью стеклянной пастеровской пипетки и осторожно вытолкните его в фиксатор или лизисный буфер, подходящий для планируемого анализа.

Двух дорсальных или двух вентральных бластомеров препарировали на 16-клеточной стадии и культивировали в одной среде XMBS при 14 °C до тех пор, пока эмбрионы-сиблинги не достигли ранних стадий развития нервной пластинки. Каждый образец анализировали на экспрессию зиготического гена нервной пластинки Sox2 методом гибридизации in situ, что визуализируется в виде синего продукта реакции.

Результаты данного анализа демонстрируют, что большинство дорсальных животных бластомеров, являющихся предшественниками нервной пластинки, способны автономно экспрессировать SOX two. То есть без дополнительных сигналов из других областей эмбриона. Те бластомеры, которые не экспрессируют SOX two, могли быть ошибочно идентифицированы в момент диссекции.

Напротив, ни один из вентральных анимальных бластомеров, которые являются предшественниками вентрального эпидермиса, не экспрессирует SOX2. Эти данные указывают на то, что дорсальные анимальные бластомеры обладают внутренней способностью формировать нервную ткань, тогда как вентральные анимальные бластомеры этой способностью не обладают. Некоторые из дорсальных бластомеров также приобрели вытянутую морфологию, что указывает на формирование дорсальной мезодермы.

Эти бластомеры также предназначены для формирования нейрулы в неповрежденном эмбрионе и в эксплантатной культуре; экспрессия белка-маркера нейрулы позволяет проверить эффект изменения эндогенных уровней материнского нейрального гена. мРНК Fox D5 вводили в вентральные клетки-предшественники на стадии 8 клеток. Как показано здесь, большинство вентральных имплантатов экспрессировали SOX 2.

Напротив, когда эндогенный уровень Fox D5 был снижен путем инъекции антисмысловых морфолино-олигонуклеотидов в дорсальные бластомеры-предшественники на стадии восьми клеток, SOX2 экспрессировалось лишь в немногих дорсальных эксплантатах. Эти эксперименты указывают на то, что материнская экспрессия Fox D5 играет роль во внутренней способности дорсальных бластомеров приобретать нейральную судьбу до начала данной процедуры. Для поиска ответов на дополнительные вопросы могут быть применены и другие методы, такие как введение в бластомеры мРНК для усиления функции или антисмысловых морфолино-олигонуклеотидов для подавления функции.

Например, какие гены участвуют во внутренней способности клеток определять конкретную судьбу развития? Кроме того, можно протестировать известные сигнальные факторы, добавляя очищенные факторы в культуральную среду. Этот подход также может быть использован для трансплантации отдельных бластомеров в новые области неповрежденного эмбриона.

Этот тест позволяет определить, сохраняет ли трансплантированная клетка свою исходную программу развития; эта информация имеет решающее значение для определения клеточных механизмов, посредством которых плюрипотентная эмбриональная клетка обретает обязательство стать предшественником определенной ткани.