Белки мембранные наложения Пробирной: протокол для тестирования Взаимодействие растворимых и нерастворимых белков В пробирке

Тестирование белков. Изучение белковых взаимодействий имеет первостепенное значение для анализа функциональных особенностей белков. В данном видео представлен метод анализа связывания белков in vitro для проверки взаимодействия между мембранным иммобилизованным белком и растворимым белком.

Сначала клонируют, экспрессируют и выделяют слитые белки. Нерастворимый меченый белок иммобилизируют на нитроцеллюлозной мембране и подвергают рефолдингу до восстановления нативной конформации. Затем мембрану инкубируют с мечеными растворимыми белками и проводят иммуноблоттинг для детекции белков.

Если меченые белки взаимодействуют, они захватываются белком, иммобилизованным на мембране, и наблюдается сигнал иммуноблоттинга. Таким образом, данный анализ представляет собой надежный метод проверки взаимодействия между нерастворимым белком и белком в растворе. Основным преимуществом этой методики по сравнению с существующими подходами, такими как GST-пулл-даун, является возможность достоверно оценить связывание нерастворимого белка с растворимым белком in vitro.

Первым этапом данной процедуры является получение генетически меченных белков для детекции. Начните с клонирования белка, который будет иммобилизован на мембране. Обозначьте его как pro Im для иммобилизованного белка в экспрессионный вектор, кодирующий крупный тег, такой как GST; пустой экспрессионный вектор, кодирующий только тег, будет использоваться в качестве отрицательного контроля иммобилизованного белка и будет обозначаться как pro IM nc.

Затем клонируйте белок, который будет использоваться в качестве растворимого зонда, в экспрессионный вектор, кодирующий другой тег, например, strep two. Этот белок будет обозначаться как prosol. В качестве отрицательного контроля клонируйте растворимый белок отрицательного контроля в тот же экспрессионный вектор. Он будет обозначаться как Prosol NC (растворимый белок отрицательного контроля).

Затем используйте систему экспрессии белков, такую как coli или balo virus, для экспрессии белков с метками. Система экспрессии должна быть тщательно подобрана исходя из требований к посттрансляционным модификациям. Выделите экспрессированные белки из выбранного организма. Для pro IM и pro I mnc Resus.

Суспендируйте клетки в буфере для нанесения на SDS-PAGE, содержащем коктейль ингибиторов протеаз. Затем прокипятите клетки в течение пяти минут и центрифугируйте их для удаления осадка, чтобы экстрагировать Prosol и prosol NC. Используйте стандартные процедуры. Экстракцию pro IMS можно проводить в денатурирующих условиях, так как белки подвергнутся рефолдингу после иммобилизации на нитроцеллюлозной мембране.

Тем не менее, для получения нативного подтверждения следует выделить просол, так как они будут добавлены в связывающий буфер после экстракции меченых белков. Определите концентрацию рекомбинантных белков с помощью стандартного метода, такого как набор для анализа белков BioRad. Это необходимо, если для анализа будет использоваться неочищенный экстракт, а не очищенный белок.

Определите концентрацию целевого белка с помощью сканирующей денситометрии соответствующей полосы на SDS-ПААГ-геле, окрашенном кумасси. В качестве эталона используйте известные концентрации BSA. Затем постройте стандартную кривую на основе интенсивности сигналов, полученных при сканирующей денситометрии BSA, и рассчитайте количество белка в неочищенном экстракте.

Следующим этапом процедуры является иммобилизация pro Iam и pro IAM NC на мембране. Начните с внесения одного микрограмма экстрактов pro Iam и pro IAM NC в двух повторностях на SDS-полиакриламидный гель. После электрофореза извлеките гель из стеклянных пластин и поместите его в 100 миллилитров трансферного буфера, затем инкубируйте при осторожном перемешивании в течение 20 минут при комнатной температуре.

После инкубации проведите вестерн-блоттинг для переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану, после чего дайте белкам, связанным с мембраной, восстановить свою третичную структуру. Поместите мембрану в 15 milliliters буфера A и инкубируйте при осторожном перемешивании. Для удаления остаточного SDS инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре при осторожном перемешивании.

После инкубации осторожно извлеките мембрану из буфера. Затем поместите мембрану в 25 миллилитров денатурирующего буфера. Инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре при осторожном перемешивании.

Во время инкубации нитроцеллюлозная мембрана станет непрозрачной. Затем, используя пинцет, перенесите мембрану в 25 milliliters TBS и инкубируйте при осторожном перемешивании в течение пяти минут. На этом этапе мембрана восстанавливает свой первоначальный белый цвет.

Затем перенесите мембрану в 25 миллилитров связывающего буфера. Инкубируйте при температуре четырех градусов Цельсия с осторожным перемешиванием в течение ночи. Далее растворимый белок будет использован для зондирования мембраны на наличие иммобилизованного белка.

Сначала подготовьте буферы для гибридизации: разведите прозоль и прозоль NC в соотношении 1 к 10 мкг в отдельных пробирках, содержащих 10 мл свежего связывающего буфера. Затем перенесите буфер в пакет для гибридизации. Далее разрежьте мембрану на две полоски, каждая из которых содержит pro IM и pro IAM nc.

Эти мембраны будут помещены в гибридизационный буфер. Перенесите каждую мембрану в гибридизационный раствор prosol или prosol NC и инкубируйте в течение 1,5 часов при комнатной температуре при осторожном перемешивании. Извлеките мембраны из гибридизационных растворов и трижды промойте их в TBS по 15 минут.

Для визуализации белок-белковых взаимодействий заблокируйте мембрану 2,5% раствором обезжиренного молока в TBST в течение одного часа. После инкубации поместите заблокированные мембраны в раствор первичных антител. В данном случае используется поликлональная кроличья антисыворотка anti-strep two.

Инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре, обеспечивая осторожное перемешивание после инкубации. Промойте мембраны в 20 миллилитрах TBST в течение 15 минут, а затем дважды по пять минут при комнатной температуре с осторожным перемешиванием. Затем поместите мембраны в раствор вторичных антител, конъюгированных с HRP; в данном случае используются антитела к кроличьему IgG, конъюгированные с HRP.

Инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре при осторожном перемешивании. Промойте мембраны в 20 миллилитрах TBST в течение 15 минут, а затем дважды по пять минут при комнатной температуре при осторожном перемешивании, как и ранее; после окончательного промывания в TBS визуализируйте белок-белковое взаимодействие с помощью ХРП-хемилюминесцентного субстрата Here Millipore. Im Molan Western Chemiluminescent.

Субстрат HRP используется после иммуноблоттинга просоля. Промойте мембрану в растворе TBST в течение 15 минут, а затем дважды по пять минут при комнатной температуре. Затем повторно инкубируйте мембраны с первичными антителами к метке pro.

Затем добавляют соответствующее вторичное антитело. Визуализируют PRO I и pro Im NNC путем регистрации хемилюминесценции для подтверждения идентичности полос, полученных в ходе анализа на белковой мембране. Взаимодействие между белками A и K, а также YFP и MP CYFP оценивали в клетках эпидермиса табака методом, описанным в данном видео, как показано здесь.

При проведении анализа биомолекулярной флуоресцентной комплементации был зафиксирован сильный сигнал YFP. Этот сигнал BFC накапливался в Punta на периферии клетки, что характерно для плазматической мембраны, так как MP является высоконерастворимым белком. При экспрессии в бактериях или растениях для подтверждения этого взаимодействия был использован метод анализа наложения белков на мембрану.

Белковые экстракты in vitro, содержащие 1 µg GST MP или несвязанного GST, разделяли методом электрофореза в ПААГ с SDS с последующим электропереносом на нитроцеллюлозную мембрану. При анализе этих мембран с использованием растворимой a nnk strep two наблюдалось связывание GST mp, но не несвязанного GST. Более того, когда тот же набор мембран анализировали с помощью неродственного белка saw nc IE цитоплазматической NADH-киназы Arabidopsis, меченной strep two, связывания не наблюдалось, что дополнительно подтверждает специфичность взаимодействия A NK MP. При выполнении данной процедуры важно не забывать правильно восполнять запасы иммобилизованных белков в соответствии с представленным протоколом.