Изображениями феромонов зондирования в мышь вомероназального острого Подготовка фрагментов тканей

Общая цель данной процедуры заключается в подготовке острого среза тканей носового органа Рукина-Торри или VNO мыши для проведения экспериментов по кальциевому имиджингу субпопуляций или отдельных нейронов в живой ткани. Это достигается путем первоначального извлечения VNO из носа мыши с последующим микродиссекированием его из хрящевой капсулы под диссекционным микроскопом в холодном A CSF. Затем изолированный VNO располагают вертикально в агаровом блоке, и с помощью микротома делают острые корональные срезы ткани для проверки ее целостности.

После проведения иммуногистохимического анализа несколько срезов исследуют с помощью конфокального микроскопа. Другие срезы насыщают кальций-чувствительным красителем, после чего проводят перфузию предполагаемыми феромонными лигандами и наблюдают за активацией нейронов с помощью кальциевого имиджинга. Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов в области обоняния.

Например, в vomeronasalном органе экспрессируются сотни рецепторов феромонов, но для очень немногих из них определены лиганды. Рецепторы феромонов крайне трудно экспрессировать в гетерологичных системах. Нам потребовалось разработать эффективный метод анализа in vivo для сопоставления конкретных феромонов с определенными рецепторами.

Мы можем использовать трансгенных мышей, в которых специфическая субпопуляция нейронов экспрессирует неизвестные рецепторы и может быть идентифицирована по экспрессии GFP. Эту методику также можно использовать для фармакологического исследования ионных каналов и ферментов, участвующих в каскаде трансдукции Fairmont, демонстрируя данную процедуру. Сегодня с нами будут Джулиан и Фабиан, два исследователя из моей лаборатории, перед началом диссекции.

Приготовьте свежую охлажденную искусственную спинномозговую жидкость (И СМЖ), насыщенную oxy carb, смешав все ингредиенты, кроме хлорида кальция. Насытите раствор, непосредственно продувая его oxy carb. Затем добавьте хлорид кальция и доведите объем до нужного значения, используя дважды дистиллированную воду.

Храните раствор A CSF на льду до использования. После эвтаназии и декапитации взрослой мыши подготовьте чашку Петри с холодным и непрерывно оксигенированным, карбонизированным A CSF. После удаления нижней челюсти поместите голову мыши в чашку Петри.

Расположите голову мыши под диссекционном микроскопе, чтобы визуализировать нёбо. Затем горизонтально надрежьте верхнюю часть нёба микроножницами и удалите слизистую оболочку нёба микродиссекционными пинцетами. Увлажните и очистите открывшуюся полость с помощью A CSF.

Отрежьте верхнюю и нижнюю части носовой перегородки. Затем осторожно извлеките носовую перегородку с вомероназальным органом (VNO) и поместите ее вертикально непосредственно в чистый искусственный спинномозговой fluid (CSF). Разделите две части VNO с помощью микрохирургического диссекционного пинцета.

Найдите хрящевую капсулу VNO, затем осторожно удалите ее, убедившись, что все фрагменты хряща извлечены. Здесь показаны изолированный VNO, фрагменты хряща и недиссецированный VNO. Сначала приготовьте 3% низкоплавящий агар, после чего подготовьте рабочее место с необходимым инструментарием. Заполните форму для заливки агаром и убедитесь, что температура ниже 41 °C перед погружением диссецированного VNO. Расположите ткань вертикально, чтобы получить корональные срезы.

Поместите форму для заливки на лед на одну минуту, пока агар не затвердеет. Через одну минуту извлеките блок агара, обрежьте его до формы параметра и приклейте к опоре микротома. Выполните корональные срезы VNO на микротоме со скоростью 0,5 миллиметров в секунду, амплитудой 0,7 миллиметров и толщиной 100 мкм в холодном CSF.

Соберите срезы ткани с помощью кисти и поместите их в планшет для культивирования тканей, заполненный холодным A CSF, чтобы убедиться в структурной целостности собранных срезов ткани, которые затем можно фиксировать и подвергать иммуноокрашиванию на компоненты цитоскелета или другие интересующие белки. Здесь иммуноокрашивание на ацетилированный тубулин фиолетовым цветом демонстрирует структурную целостность среза ткани. Кроме того, наблюдение за специфической популяцией нейронов, где определенный рецептор феромона был помечен GFP, показывает сохранную морфологию нейронов: при работе в темной комнате можно наблюдать нейроны с небольшими овальными телами клеток и длинными дендритами, достигающими поверхности просвета и заканчивающимися микроворсинками.

Инкубируйте срезы VNO в загрузочном растворе холодного A CSF с 7 µM URA 2:00 AM и 0,1% onic в течение одного часа при 37 °C. После завершения инкубации храните загруженные срезы на льду в условиях оксикарбонации до момента использования. С помощью кисти поместите загруженные срезы в перфузионную камеру, содержащую A CSF, и зафиксируйте их с помощью анкера для тканевых срезов.

Поместите перфузионную камеру на предметный столик микроскопа с установкой для кальциевого имиджинга и обеспечьте непрерывную перфузию искусственной спинномозговой жидкостью (CSF), насыщенной кислородом и карбонатами, при комнатной температуре. Наблюдайте за загруженными срезами VNO, используя длины волн флуоресценции, соответствующие красителю, которые составляют 400–480 нм для Fluo-4. Используйте подходящее программное обеспечение для записи изменений соотношения внутриклеточного кальция. Для проведения хемостимуляции необходима система перфузии.

Здесь представлен корональный срез ткани vno мыши, у которой субпопуляция нейронов, экспрессирующих феромонный рецептор V one RB two, также экспрессирует GFP; проведен иммуноокрас на ацетилированный тубулин, показанный фиолетовым цветом. Виды среза при большем увеличении демонстрируют сохранение целостности ткани. Показаны нейроны с длинными дендритами, достигающими поверхности просвета, а экспрессия структурного белка видна в дендритных утолщениях и микроворсинках для кальциевого имиджинга.

Срезы тканей, нагруженные FU, сначала визуализируют с помощью фазово-контрастной микроскопии Хоффмана, чтобы определить интересующую область, начиная с кровеносного сосуда (первая белая стрелка); затем наблюдатель медленно продвигается к просвету (вторая белая стрелка) и нейроэпителиальной области. Овальное тело клетки норонного нейрона RO. Третью белую стрелку можно идентифицировать по его длинному и тонкому дендриту.

Четвертая белая стрелка указывает в просвет — на дендритный бутоне нейрона. Пятая белая стрелка указывает на микроворсинки, контактирующие с клетками, нагруженными феромонами RA; здесь показано, что они последовательно освещаются на длинах волн 380 нм, затем 340 нм и снова 380 нм, и это соотношение длин волн флуоресценции сопоставляется с изменениями внутриклеточного кальция в выбранных нейронах (черные, красные и синие кружки). ATP используется для определения жизнеспособности нейронов.

Обратите внимание на диапазон кальциевых ответов, наблюдаемых в трех выбранных нейронах, а также на тот факт, что нейрон номер два (красный круг) не отвечает на TP и поэтому будет исключен из дальнейшего анализа. Затем проводится хемостимуляция с использованием мочи и смеси феромонов мыши при исследовании глубины среза ткани. Таким образом можно локализовать субпопуляцию нейронов, экспрессирующих как GFP, так и рецептор V1RR2.

Здесь показан нейрон, экспрессирующий как GFP, так и рецептор V1RB2, рядом с нейроном, не экспрессирующим V1RB2. Обе клетки нагружены URA 2:00 AM, и нейрон, экспрессирующий V1RB2, демонстрирует кальциевый спайк в ответ на перфузию лиганда рецептора 2-гепнона. Интересно, что нейрон, не экспрессирующий V1RB2, также реагирует на 2-гепнон, что демонстрирует сложность феромонного кодирования в VNO.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как извлекать и микродиссецировать орган Маара у мыши для приготовления острых срезов ткани. Данный протокол также может быть адаптирован для физиологических исследований с использованием других кальциевых красителей и конфигураций микроскопов. Желаем удачи в проведении вашего эксперимента.