Твердофазные Submonomer Синтез Peptoid полимеров и их самосборки в Высоко-упорядоченные нанолистов

Общая цель данной процедуры — описание простого и эффективного метода твердофазного синтеза пептидов и их последующей самосборки в водной среде в высокоупорядоченные нанолисты. Пептиды, структурно схожие с полипептидами, представляют собой полимеры замещенного глицина, в которых боковые цепи присоединены к азоту, а не к альфа-углероду. Процесс начинается с синтеза специфической пептидной последовательности с использованием метода субмономеров.

Метод субмономеров состоит из двух простых химических стадий, в ходе которых каждый мономер последовательно вводится в цепь. Сначала амин, прикрепленный к твердой подложке, подвергается бромацетилированию. Затем бром замещается первичным амином.

Эти стадии повторяют до достижения желаемой длины цепи. После удлинения цепи пептид отделяют от твердого носителя, полученное сырое пептидное масло очищают методом ВЭЖХ и характеризуют для инициирования самосборки пептидов в нанолисты. В стеклянном флаконе готовят разбавленный водный буферный раствор пептида и осторожно перемешивают. В качестве заключительного этапа.

Нанолисты исследуют под микроскопом. Результаты показывают, что итерационный цикл из двух простых химических стадий позволяет получить последовательность-специфичный полимер, который спонтанно самоорганизуется в нанолисты. Пептиды представляют собой новый класс биомиметических полимеров со свойствами, промежуточными между свойствами белков и традиционных полимеров.

Пептиды обладают прочностью и синтетической универсальностью традиционных полимеров, но при этом являются высоконастраиваемыми и последовательно-специфичными, как белки и ДНК. Они становятся передовым материалом для решения ключевых проблем биомедицины и материаловедения, таких как идентификация биоактивных лекарственных средств или дизайн искусственных белков. Основными преимуществами пептидов являются точный контроль последовательности, доступность невероятно разнообразных строительных блоков, эффективность синтеза и стабильность к протеазам. В данной работе описывается общий метод ручного синтеза пептидов с использованием базового оборудования и коммерчески доступных реагентов, что позволяет легко синтезировать пептиды в большинстве лабораторий.

Визуальная демонстрация этапов синтеза имеет критически важное значение и служит ценным руководством для специалистов, начинающих работу в области твердофазного синтеза. В данной работе впервые описываются очистка и характеристика амфифильного пептида из 36 меров, а также его самосборка в высокоупорядоченные нанолисты. Начните выполнение данного протокола с настройки экспериментальной установки, как описано в текстовом руководстве.

Для наглядности следующие действия будут выполняться в стекком реакционном сосуде вместо одноразового полипропиленового картриджа с пористым фильтром. После помещения 100 milligrams смолы R amide в реакционный сосуд с пористым фильтром набухайте смолу, добавив two milliliters диметилформамида или DMF, и перемешивайте путем барботирования в течение 10 minutes. Затем слейте раствор с помощью вакуума, чтобы выделить набухшую смолу.

Затем добавьте один миллилитр 20% раствора N-метилпиридина в DMF для снятия защиты с FM O-группы. Перемешивайте в течение двух минут, после чего слейте жидкость. Повторяйте эту процедуру в течение 12 минут, затем промойте смолу, добавив два миллилитра DMF, перемешивая в течение 15 секунд и сливая жидкость.

Начните наращивание пептидной цепи с первого цикла субмономера, который включает стадию бромацетилирования и стадию замещения. Для бромацетилирования добавьте 1 ml 0,6 M бромуксусной кислоты в DMF и 86 µL диизопропилкарбодиимида. После перемешивания в течение 30 минут слейте раствор и промойте 2 ml DMF.

Затем проведите замещение, добавив 1 мл 1–2 М раствора амина в N-метилпирролидоне; инкубируйте от 30 до 120 минут. По завершении инкубации слейте раствор и промойте систему 2 мл DMF. Продолжайте наращивание пептидной цепи, повторяя цикл добавления мономера. После проведения последнего этапа замещения промойте систему 2 мл DMF.

После этого закройте сосуд колпачком для промывки метаном diora и храните реакционный сосуд до момента расщепления. Чтобы начать расщепление, перенесите всю высушенную смолу в сцинтилляционный стеклянный флакон объемом 20 milliliter, работая в вытяжном шкафу и используя соответствующие средства индивидуальной защиты; добавьте в сцинтилляционный стеклянный флакон четыре milliliters трифторуксусной кислоты или коктейля для расщепления TFA и закройте крышкой. Тщательно перемешивайте от 10 минут до двух часов при комнатной температуре.

В качестве альтернативы для перемешивания раствора можно использовать ротационный шейкер. Соберите раствор после расщепления TFA, профильтровав смолу через одноразовый полипропиленовый фильтр-картридж в новый предварительно взвешенный стеклянный флакон для сцинтилляции объемом 20 миллилитров. Затем добавьте один миллилитр свежего коктейля для расщепления, чтобы промыть смолу и собрать остатки пептида.

Повторите эту процедуру, промойте дважды. Удалите TFA, обдувая мягким потоком азота или используя био-заряд. V 10 испаритель red растворите неочищенное масло в шести миллилитрах смеси ацетонитрила и воды в соотношении 1:1.

Затем заморозьте и лиофилизируйте образец. Эту процедуру следует повторить еще раз после второй лиофилизации. Зафиксируйте массу сырого продукта, храните его в виде сухого порошка при температуре -20 °C и проанализируйте с помощью аналитической ВЭЖХ и/или ЖХ-МС с электрораспылением.

Чистоту неочищенного продукта и наличие молекулы с требуемым молекулярным весом можно определить, следуя процедурам, изложенным в тексте. Затем смесь неочищенных пептидов можно очистить с помощью препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ в соответствии с описанной процедурой. В данном разделе приводится протокол формирования листов из одноцепочечной последовательности специфического амфифильного 36 me пептида.

После синтеза, очистки и лиофилизации пептидной цепи полученный белый порошок растворяют в DMSO для приготовления основного раствора с концентрацией 2 мМ. Затем, используя файл Dr.Glass, готовят пептидный раствор с концентрацией 20 мкМ. Для этого сначала добавляют 445 мкл воды milli Q и 50 мкл 10-кратного буфера для формирования листов.

Перемешайте содержимое флакона на вортексе. Затем добавьте 5 µL стокового раствора пептида с концентрацией 2 мM и осторожно перемешайте. Результирующие листы раствора образуются путем осторожного перемешивания разбавленного водного раствора пептида.

Медленно наклоните закрытый стеклянный флакон из горизонтального в вертикальное положение. Это приводит к образованию листов при осторожном встряхивании, что также дает листы. Однако при таком способе листы, как правило, получаются меньшего размера и с меньшим количеством прямых краев, чем при получении многих высококачественных листов.

Медленно вращайте стеклянные флаконы вокруг горизонтальной оси в течение одного дня, используя ротатор для пробирок или специально сконструированный качалку, для флуоресцентного окрашивания нанолистов; добавьте 1 µL 100 µM Nile red к 100 µL раствора нанолистов, чтобы получить конечную концентрацию 1 µM Nile red. Nile red представляет собой чувствительный к окружающей среде краситель, интенсивность флуоресценции которого увеличивается при локализации в гидрофобных средах. Затем приготовьте 1% раствор ароса в горячей воде и налейте его в пластическую чашку Петри.

Убедитесь, что слой раствора агарозы имеет толщину примерно 1/8 дюйма, и дайте раствору остыть в состоянии покоя на плоской поверхности. После застывания агарозы с помощью шпателя вырежьте квадраты размером 1 см на 1 см. Затем перенесите вырезанные квадраты на предметное стекло, чтобы расположить их в одной плоскости, и нанесите 1 µL раствора образца на каждый кусочек агарозы.

Через две минуты aros должны поглотить буфер, в результате чего листы останутся на поверхности. Снимите изображение листа в течение 15 минут. В качестве альтернативы, для визуализации листов и раствора нанесите 15 µL внутрь прокладки диаметром 20 мм и толщиной 0,12 мм на предметном стекле.

Накройте образец покровным стеклом и проведите визуализацию в течение нескольких дней для выполнения СЭМ нанолистов. Сначала подвергните кремниевые чипы плазменному травлению, чтобы облегчить адсорбцию нанолистов. Затем нанесите 20 µL раствора пептидных листов на обработанную плазмой кремниевую подложку и оставьте раствор на три минуты; удалите излишки раствора кончиком салфетки Kimwipe, нанесите 20 µL воды на поверхность и снова удалите излишки раствора, чтобы вымыть буфер и соли.

В качестве альтернативы растворы пептидных листов подвергают диализу против воды для удаления буфера и соли. В этом случае 20 µL диализированного раствора листа можно нанести каплей на кремниевые подложки, обработанные плазмой, и оставить высыхать на воздухе. После высыхания раствора листа на обработанных плазмой кремниевых подложках изображение листа можно получить с помощью СЭМ, используя внутрилинзовый детектор при энергии пучка от 1 kV до 5 kV.

Был проведен синтез, характеризация и очистка последовательно-специфичного блок-заряженного пептида из 36 me, который сворачивается в высокоупорядоченный двумерный нанолист. При синтезе блок-заряженного пептида из 36 me использовались амины этилендиамин, фенэтиламин и т-бутил-бета-аланин. После синтеза сырой пептид был отделен от смолы с помощью 95% водного TFA.

После сбора и выпаривания раствора ТФУ сырой блок-заряженный пептид 36 me очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Затем массу очищенного блок-заряженного пептида подтверждали методом масс-спектрометрии.

Наблюдаемая масса 4981.2 близка к расчетной массе 4981.74. Лиофилизированный порошок растворяли в DMSO для приготовления стокового раствора с концентрацией 2 мМ, который хранили при температуре 4 °C. Образцы подложек готовили согласно вышеописанному протоколу и визуализировали с помощью флуоресцентной оптической микроскопии.

Наблюдаются структуры различных форм с размерами элементов до 300 микрон, при этом особенно заметны прямые края. Также была использована СЭМ для получения изображений листов, что аналогичным образом выявило выраженные прямые края. В данном видео описывается простой и эффективный протокол синтеза пептидов на твердой фазе и их последующей самосборки в водной среде в нанолисты.

Поскольку в распоряжении имеется буквально сотни доступных аминокислотных строительных блоков, которые могут быть использованы в данном протоколе, пространство дизайна полипептидов практически безгранично. Пептиды являются перспективными материалами для биомедицинских и нанонаучных исследований благодаря их синтетической гибкости, стабильности и упорядоченности. В частности, на атомном уровне нанолисты могут служить потенциальной платформой для двумерных дисплейных каркасов, миметиков мембран, биологических сенсоров, миметиков белков и изготовления устройств.

Работа с коррозионными реагентами, такими как триор, уксусная кислота и бром уксусная кислота, чрезвычайно опасна; во избежание травм проводите все реакции в вытяжном шкафу и используйте соответствующие средства индивидуальной защиты.