Высокая пропускная способность кристаллизации мембранных белков, используя метод липидный Bicelle

В данном видео будет продемонстрирован метод постановки высокопроизводительных экспериментов по кристаллизации очищенных мембранных белков с использованием липидных B-клеток. Сначала готовят B-клетки путем смешивания липида и детергента, затем в смесь B-клеток вводят очищенный мембранный белок, после чего с помощью нанолитрового робота проводят серию экспериментов по кристаллизации. Визуальный осмотр с использованием стандартного светового микроскопа позволяет выявить наличие кристаллов.

После формирования белковые кристаллы можно извлечь и заморозить для сбора данных и определения структуры. Основным преимуществом данного метода является то, что благодаря уникальному фазовому поведению B-клеток для кристаллизации можно использовать стандартное лабораторное оборудование и робототехнику. Создание B-клеток — это достаточно простой метод, который позволяет перевести целевой мембранный белок из детергентной среды в липидную среду.

Это предоставляет вам совершенно новый набор условий для скрининга. Данный метод настолько прост и успешно применялся для многих мембранных белков, что нет никаких причин не попробовать его. Первым этапом кристаллизации на основе B-клеток является приготовление смеси липидных амфифилов, формирующих B-клетки.

Этот процесс требует значительных усилий и является наиболее трудоемким. Обратите внимание, что его завершение может занять несколько часов. B-клетки могут формироваться при различных комбинациях липидных амфифилов и в широком диапазоне концентраций.

Рекомендуемые начальные параметры приведены в таблице 1 прилагаемого письменного протокола. Начните с приготовления 1.0 мл смеси 35% DMPC и Chapo в молярном соотношении 2,8:1. Для этого в пробирку отвешивают 0,26 г DMPC и 0,09 г Chapo. Доведите объем до 1.0 мл с помощью деионизированной воды и перемешайте смесь на вортексе.

Затем нагрейте смесь примерно до 40 °C на водяной бане, пока она не приобретет гелеобразную консистенцию. Поместите пробирку на лед. Образец должен снова стать жидким.

Затем снова перемешайте на вортексе в течение нескольких минут; продолжайте циклически повторять этапы нагревания, охлаждения и перемешивания на вортексе до полного растворения липида. Обратите внимание, что по мере увеличения количества циклов смесь может стать мутной при охлаждении по завершении процесса. При температуре комнатной или выше смесь представляет собой прозрачный гель, а на льду — вязкую жидкость; клетки можно хранить при температуре -20 °C для длительного хранения.

Затем очищенные белки вводят в среду для B-клеток. Это простой процесс, который следует проводить в тот же день, что и кристаллизацию, продемонстрированную в следующем разделе видео. Разморозьте смесь DMPC capso и B-клеток при комнатной температуре до тех пор, пока фаза не сменится на прозрачный гель.

Поместите смесь на лед для разжижения, затем коротко перемешайте ее на вортексе, чтобы восстановить однородную фазу В-клеток. С этого момента держите смесь В-клеток и очищенный белок на льду. Это позволит поддерживать В-клетки в жидкой фазе, что облегчит их дозирование с помощью пипетки.

Затем добавьте смесь B-клеток к очищенному белку, сольватированному детергентом, в соотношении один к четырем по объему. Затем осторожно перемешайте раствор путем пипетирования до тех пор, пока он не станет прозрачным и однородным. Если появились пузырьки, коротко центрифугируйте пробу в настольной центрифуге для их удаления.

Инкубируйте смесь на льду не менее 30 минут для обеспечения полного включения белка в клетки. Смесь белка с клетками теперь готова к проведению экспериментов по кристаллизации. Эксперименты по кристаллизации будут продемонстрированы с использованием робота для кристаллизации mosquito.

Охладите 96-луночный планшет с V-образным дном, поместив его на лед. Перенесите смесь белка и клеток в планшет с помощью пипетки, чтобы обеспечить минимальную вязкость раствора. Держите смесь белка и клеток на льду до выполнения последнего этапа.

Используемый здесь робот имеет пять платформ. Поместите микропланчинку с резервуаром на платформу три, а крышку для кристаллизации, на которую будут наноситься капли, — на платформу пять. Затем установите планшет с белком, полученным из клеток, на платформу четыре, максимально близко к позиции дозирования.

Это гарантирует, что смесь белка и клеток будет захвачена роботом последней и сразу же высвобождена. Запустите выполнение программы с помощью программного обеспечения; робот захватит раствор из резервуара, затем смесь белка и клеток и нанесет их на крышку в виде капель, чтобы предотвратить нагрев и повышение вязкости в процессе дозирования. Не программируйте устройство Mosquito на перемешивание содержимого резервуара со смесью белка и клеток сразу по завершении цикла.

Извлеките планшет с белком из прибора и поместите его на лед. Снимите крышку с прибора и поместите ее на планшет с резервуарным раствором таким образом, чтобы капли оказались перевернутыми. Инкубируйте планшет при 20 °C.

Обратите внимание, что для формирования и оптимизации кристаллов можно протестировать и другие температурные режимы. Более высокие температуры индуцируют ламеллярную фазу, преимуществом которой является предварительная организация белка в слои. Можно провести скрининг температур в диапазоне от 4 °C до 20 °C.

При температуре ниже 4 °C липиды могут выпадать в осадок. В течение длительного периода времени — в первый, третий день, а затем еженедельно — оценивайте появление и рост кристаллов с помощью стандартного светового микроскопа. Здесь представлены изображение в светлом поле и УФ-изображение игольчатых кристаллов, наблюдаемых только в условиях воздействия. Флуоресценция кристаллов не была обнаружена, что указывает на ложноположительный результат на данном изображении.

Стержневидный кристалл, образовавшийся при использовании метилпропандиола в качестве осадителя. Кристалл проявлял слабую флуоресценцию, что указывало на возможность того, что это кристалл белка, однако при рентгеновской дифракции было установлено, что он не является белковым. На данном изображении представлен кристалл, наблюдаемый примерно через четыре недели после постановки опытов.

Сильная флуоресценция под УФ-светом подтверждает, что это кристалл белка, как вы видели на данном видео. После получения B-клеток их можно смешать непосредственно с очищенным белком, и с этого момента процесс кристаллизации протекает практически так же, как в стандартных протоколах на основе детергентов.

Еще одним существенным преимуществом является возможность допирования B-клеток специфическими липидами в целях оптимизации. Данный метод отличается высокой универсальностью и настолько прост в применении, что его следует использовать во всех проектах по кристаллизации мембранных белков.