Оценка Двумерные Кристаллизация Испытания малых мембранных белков для структурных исследований биологии электронным кристаллографии

Общая цель данной процедуры заключается в определении наиболее оптимальных условий 2D-кристаллизации для структурного анализа мембранных белков методом электронной кристаллографии. Это достигается путем первоначального использования совместимого детергента в процессе очистки для солюбилизации белка из нативного липидного бислоя. Вторым этапом процедуры является добавление экзогенных липидов и удаление детергента посредством диализа смеси белка, липидов и детергента, что приводит к образованию 2D-кристаллов в строго контролируемых условиях.

Третьим этапом процедуры является мгновенное замораживание образцов до витрифицированного состояния. Заключительным этапом процедуры является сбор данных с помощью крио-ЭМ. В итоге, путем компьютерной обработки полученных данных, можно определить окончательную структуру белка.

Здравствуйте, я представляю лабораторию Школы биологии Джорджийского технологического института. Здравствуйте, я Тина Дредд.

Я представляю лабораторию Берри химического и биохимического факультета, а также лабораторию Шмидт-Край биологического факультета Технологического института Джорджии. А я — Мэтт Джонсон из лаборатории Ингеборг Шмидт-Край биологического факультета Технологического института Джорджии. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру оценки результатов 2D-кореляции с помощью ЭМ.

Мы используем данный протокол в нашей лаборатории для определения и оптимизации условий 2D-кристаллизации. Итак, приступим. Для начала данной процедуры подготавливают образцы с негативным контрастированием на медных сетках для просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) с размером ячейки 400 mesh и углеродным покрытием. Пипеткой нанесите 2 µL образца протеолипосом под углеродную пленку сетки ПЭМ и инкубируйте в течение 60 секунд.

Если образец распределился неравномерно, аккуратно разровняйте его боковой стороной наконечника пипетки. Затем промокните жидкость по краю с помощью обрывка фильтровальной бумаги Whatman № 4. Это обеспечит оптимальное удаление жидкости без избыточного смыва липосом protea и поможет сохранить целостность хрупкой углеродной пленки.

Сразу после промакивания. Через 30 секунд нанесите два микролитра 1% раствора уранилацетата, затем удалите излишки с края сеточки. Опять же, если образец содержит высокие концентрации вязкого глицерина или сахарозы, обычно в диапазоне от 10 до 20%, перед негативным окрашиванием может быть полезно провести несколько циклов промывки сеточки буфером, не содержащим глицерина или сахарозы, чтобы обеспечить надлежащее окрашивание раствором уранилацетата.

После подготовки сеток используют электронную микроскопию для визуализации образца при низком увеличении, чтобы оценить распределение и морфологию мембран, а также общее качество сеток. Затем при высоком увеличении получают изображения и выполняют преобразования Риемана (RIA) этих изображений для идентификации 2D-кристаллов. Чтобы начать работу, поместите сетку в держатель образцов электронного микроскопа и используйте промежуточное увеличение от 2000 до 10 000 x, чтобы получить первое представление о среднем распределении мембран.

Отметьте в лабораторном журнале степень распределения мембран, их морфологию и размер. Зафиксируйте репрезентативные изображения с помощью ПЗС-камеры. Затем, при необходимости, осмотрите образцы при малом увеличении в диапазоне примерно от 400 до 800 x, чтобы получить общий обзор сеток.

Это может дать ценную информацию для оценки качества подготовки сеток, выявив проблемы с концентрацией образца, неравномерным распределением протеин-липосом и частичным разрывом угольной пленки. Определите интересующую область сетки при малом или среднем увеличении. Затем используйте большое увеличение для оценки возможного порядка в различных мембранах.

Это имеет решающее значение на ранних этапах проб 2D-кристаллизации. Чтобы выявить перспективные белковые липосомы с хорошо упорядоченными областями и проверить воспроизводимость в ходе последующих экспериментов, при определении оптимального увеличения для скрининга 2D-кристаллов начните с увеличения в диапазоне от 50 000 до 60 000 x. В зависимости от размеров 2D-кристалла и размера элементарной ячейки, значение высокого увеличения может быть снижено до 30 000 или повышено до 80 000.

Здесь, на участке, смежном с областью интереса на изображении, мы устанавливаем дефокусировку примерно на -400 nanometers или больше, если есть сомнения в том, что исследуемая область действительно является мембраной. Осмотрите образец на наличие фрагментов углеродной пленки, MICA или других артефактов, которые можно принять за протеолипосомы. Также изучите края, чтобы определить типичную складчатость и морфологию мембран.

Затем исследуйте область интереса с помощью ПЗС-камеры. При получении ПЗС-изображения с оптимальным высоким увеличением решетка более мелкого и/или преимущественно гидрофобного мембранного белка может быть не видна при визуальной оценке самого изображения. В этом случае всё изображение используется для расчета быстрого преобразования Фурье (БПФ) в режиме реального времени.

Однако, если упорядоченный массив мал, это БП будет содержать значительный объем шума. Чтобы улучшить соотношение сигнал/шум, уменьшите размер выделенной области изображения, переместите уменьшенную область над изображением и выполните БП в реальном времени; отрегулируйте гамма-функцию БП в реальном времени для оптимальной идентификации упорядоченных массивов. Слишком высокое значение гамма может скрыть пятна из-за влияния шума, в то время как чрезмерно низкое значение помешает идентификации более слабых пятен. Ожидаемое разрешение 2D-кристаллов с негативным контрастированием составит примерно 15 angstroms при DFO минус 400 nanometers.

Ожидайте увидеть от одного до трех порядков рефлексов. Обратите внимание на четкость пятен и наличие мозаичности. 2D-кристаллы небольшого мембранного белка массой 18 килодальтон могут достигать нескольких микрон в размере.

Четкие и легко идентифицируемые пятна на FTS и их закономерное перемещение при сдвиге FT-бокса в реальном времени свидетельствуют о непрерывности решетки и отсутствии мозаичности. Решетка более крупного белка с более обширным растворимым доменом может быть видна на малом экране системы сбора изображений T-E-M-C-C-D, однако для более точной оценки качества решетки необходимы FT, позволяющие выявить такие характеристики, как мозаичный шум в FT неупорядоченного белка. Липосомы могут быть ошибочно приняты за слабые пятна; чтобы определить, вызваны ли пятна малыми 2D-кристаллами белка или шумом, требуется дополнительный анализ.

Переместите коробку для живого ft. Если пятна исчезают мгновенно, это шум, но если они остаются неизменными даже на небольшой области, вероятно, присутствуют кристаллы, так как липидные кристаллы обладают характерной морфологией и ft. Эти липидные кристаллы также можно распознать путем визуального осмотра изображения и по одинаковому размеру элементарных ячеек.

В ходе первых испытаний может наблюдаться выпадение осадка. Для того чтобы отличить преципитацию белков от липидных агрегатов, используют исследование при большом увеличении. В случае обнаружения липидных агрегатов реконституция могла фактически произойти, и в последующих экспериментах потребуется лишь корректировка параметров, необходимых для увеличения размера мембран и упорядочивания структуры, а не для индуцирования реконституции при 30,000–50,000 ×g.

Края этих темных структур показывают, что они состоят из мембран, не содержащих белков. Образцы, полученные путем осаждения при оптимальных условиях, будут содержать большой процент 2D-кристаллов. Нет необходимости стремиться к однородному виду мембран, поскольку для сбора данных визуально отбираются самые крупные и наиболее упорядоченные 2D-кристаллы.

Такие образцы будут легко распознаваемы при кристаллизации; подобные образцы используются для сбора данных методом криоэлектронной микроскопии (cryo EM) с целью получения максимального количества изображений высокого разрешения. В данной процедуре мы продемонстрируем вам способ скрининга 2D-кристаллов малых мембранных белков с помощью ПЭМ (TEM). Важно помнить о необходимости тщательного подхода, чтобы не упустить перспективное условие кристаллизации, поскольку к этому моменту вы уже затратили значительное количество времени и усилий.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.