Кристаллизующихся мембранных белков для определения структуры использования липидный Мезофазы

Здравствуйте и добро пожаловать в группу структурной и функциональной биологии мембран. Меня зовут Мартин Каффери. В центре наших исследований находится биологическая мембрана, схема которой представлена на первом слайде; мембрана, окружающая клетку и, при их наличии, субклеточные органеллы, представляет собой молекулярно тонкую структуру шириной всего в две липидные молекулы, в которую встроены белки.

Нас интересуют структура и функции, применимые как к липидам, так и к белкам. Однако в рамках данной серии JO я сосредоточусь исключительно на мембранных белках. Мы стремимся понять, как эти мембранные белки функционируют на молекулярном уровне, по двум причинам.

Во-первых, существует интеллектуальное удовлетворение от понимания принципов работы чего-либо. Во-вторых, знание того, как устроена система — подобно тому, как вы знаете устройство своего велосипеда или автомобиля, — дает возможность ее починить в случае неисправности. Разработка лекарственных препаратов является очевидным результатом работы такого рода.

Подход, который мы используем для выяснения механизмов работы мембранного белка на молекулярном уровне, заключается в определении его кристаллографической структуры. Это предполагает установление координат в трехмерном пространстве всех атомов или, по крайней мере, всех атомов, кроме водорода, из которых состоит белок. Метод, применяемый нами для этой цели, называется макромолекулярной рентгеновской кристаллографией (сокращенно MX).

Здесь представлен пример мембранного белка, структура которого была определена с помощью MX; для проведения MX требуется кристалл белка определенного качества. Как можно представить, определение структуры методом макромолекулярной кристаллографии включает в себя множество этапов, как показано здесь. Обычно они включают выбор целевого мембранного белка, а затем его экспрессию, очистку и кристаллизацию.

Дифракционные измерения кристалла проводятся с использованием лабораторного или синхротронного источника рентгеновского излучения. Данные дифракции обрабатываются с получением карты электронной плотности, по которой затем подбирается молекулярная модель. После уточнения модель может быть использована для изучения механизма действия белка и для разработки лекарственных препаратов на основе анализа структуры.

Целью данной статьи JoVE является демонстрация способа получения высококачественных кристаллов мембранных белков с использованием липидных мезофаз с помощью так называемого метода in meso. Свежий обзор этого метода и области его применения представлен в источнике 1. Пошаговый протокол, которому мы будем следовать, описан в источнике 2; здесь приведена блок-схема, обобщающая этапы и время, необходимые для постановки эксперимента по кристаллизации мембранного белка методом in meso.

В этом видео рассматриваются этапы, обведенные красным пунктиром. Здесь показаны действия, которые необходимо выполнить при проведении мезокристаллизации в ручном режиме. Они включают использование концентрированного раствора очищенного мембранного белка и липида для создания матрицы, обычно моноолеина, чтобы липид был более заметен.

В этом видео используются растворы осадителя с красным красителем, дозаторы с очищенной водой, одноразовые наконечники и набор газоплотных шприцев Hamilton, некоторые из которых со сменными иглами, соединитель с узким отверстием для смешивания белкового раствора с липидами для получения мицелл. Повторяющийся дозатор Hamilton, стеклянные предметные и покровные стекла. Идеально силилизированная перфорированная двухсторонняя клейкая лента-спейсер для создания лунок, пинцет, дробленый лед, салфетки, калькулятор и, самое главное, ваш лабораторный журнал.

Следующая процедура используется для подготовки стеклянной сэндвич-пластины для кристаллизации. Для начала работы поместите силилизированное предметное стекло на лабораторный стол. Снимите защитную бумажную подложку с одной поверхности полоски перфорированной двусторонней разделительной ленты.

Приложите клейкую сторону ленты к поверхности предметного стекла с нажимом. Плотно прижмите ленту к стеклу. С помощью брайера или ролика закрепите ленту; чтобы защитить дно лунок, между лентой и роликом можно проложить алюминиевую фольгу.

Отделите вторую бумажную подложку от ленты, чтобы открыть ее верхнюю липкую поверхность. В результате этой процедуры получается стеклянная пластина, готовая к загрузке и последующему герметизированию сразу после завершения загрузки. Индивидуальные силиконизированные покровные стекла должны находиться в непосредственной близости от пластины для быстрого и эффективного герметизирования лунок.

Поместите липид в термоблок с контролируемой температурой при 45 °C на три минуты до полного расплавления. Обратите внимание, что обычно используется моноландановый липид. В данном видео в липид добавлен красный краситель для визуализации процесса плавления.

Подготовьте два газоплотных шприца Hamilton объемом 100 µL для использования на этапе смешивания липидов и белков; удалите тефлоновую смазку из шприца, в котором будет находиться белковый раствор. Рядом с ним поместите шприц, предназначенный для липидов. В данном случае смазка остается на месте.

Установите соединитель с узким отверстием между двумя шприцами, затем подсоедините его к носику шприца с липидами. Затяните соединитель на шприце, избегая чрезмерной затяжки. Извлеките поршень из цилиндра шприца с липидами.

Убедитесь, что липид находится в расплавленном состоянии. Установите объем дозатора на 30 µL и медленно наберите 30 µL расплавленного липида из флакона. Флакон с липидом.

Липид следует хранить в атмосфере азота или аргона при температуре -80 °C. Медленно введите максимально возможное количество расплавленного липида в открытый конец шприца, стараясь не допустить образования воздушных прослоек.

Вставьте поршень в цилиндр так, чтобы он соприкасался с расплавленным липидом, и медленно продвигайте поршень вверх по цилиндру, удерживая шприц вертикально. Как показано на видео, случайно попавший пузырек воздуха в процессе этого действия поднимается вверх и выходит наружу. Теперь в цилиндре находится пробка из расплавленного липида, объем которой необходимо точно определить.

Это можно сделать, считав показания по шкале на цилиндре шприца. В данном случае объем составляет 23 µL, что заносится в лабораторный журнал. Наденьте мех на иглу, выходящую из соединителя.

С помощью поршня вытолкните расплавленный липид вверх по цилиндру, медленно и осторожно направляя его в иглу в центре соединителя. Если игла будет слегка переполнена, липид начнет вытекать из ее открытого конца. Слегка отведя поршень назад, можно втянуть излишки липида обратно в соединитель, пока он не окажется вровень с кончиком иглы соединителя.

В данном случае блок соединителя шприца полностью заполнен и готов к соединению со шприцем с белком. Раствор следует центрифугировать при 14,000 G в течение 10 мин, а затем от 5 до 10 минут при четырех градусах Цельсия для удаления крупных агрегатов. Перед постановкой экспериментов по кристаллизации извлеките раствор белка из контейнера со льдом и выдержите его при комнатной температуре для уравновешивания.

Рассчитайте объем белкового раствора, который необходимо использовать для формирования кубической фазы при полной или близкой к ней гидратации для олеата при 20 °C. Полная гидратация водой occurs при содержании воды около 40% по весу, как показано на фазовой диаграмме. Напомним, что шприц с липидами был заполнен 23 мкл моноолеата с плотностью 0,94 мг/мкл.

Это соответствует 21,6 миллиграммам липидов, таким образом, необходимо 21,6 умножить на четыре и разделить на шесть, что составляет 14,4 миллиграмма или 14,4 µL раствора белка; с помощью шприца Hamilton объемом 25 или 50 µL наберите необходимый объем раствора белка, перенесите раствор на тефлоновый наконечник поршня в цилиндре шприца. Осторожно извлеките иглу, стараясь не допустить появления пузырьков воздуха, и измерьте объем раствора белка в шприце. Он должен соответствовать значению, полученному на предыдущем этапе.

Для подготовки к объединению с шприцем, заполненным липидами, осторожно продвиньте белковый раствор по цилиндру так, чтобы его уровень был вровень с открытым концом. Это можно контролировать, глядя сквозь торец цилиндра.

Раствор белка липина и заполненные шприцы готовы к объединению. Для этого вкрутите шприц с белком в открытый конец соединителя, прикрепленного к шприцу с липидами. После объединения двух шприцев с помощью соединителя должен образоваться непрерывный объем жидкости, идущий от липидов в одном шприце через соединитель к раствору белка в другом шприце.

При подготовке к смешиванию собранный блок удерживают обеими руками: один шприц в правой руке, другой — в левой. К обоим цилиндрам через соединитель прикладывается крутящий момент, используя пальцы и большие пальцы обеих рук, чтобы обеспечить герметичность уплотнения в канавках соединителя при затягивании. Повреждение ALS в собранном устройстве для смешивания на данном этапе, а также чрезмерное затягивание приведут к утечке.

Это вопрос опыта, который неизбежно включает в себя метод проб и ошибок и периодическую потерю образцов. Поэтому целесообразно потренироваться на липидах и воде или буферном растворе, чтобы освоить работу с системой, прежде чем переходить к использованию ценного белкового раствора. Для осуществления смешивания с помощью большого или указательного пальца продвиньте плунжер со стороны белка в собранном смешивающем устройстве до упора, вытесняя белковый раствор из шприца с белком через соединитель в шприц с липидами. Если устройство было герметизировано эффективно, это действие вызовет равное и противоположное движение плунжера со стороны липидов.

Теперь с помощью поршня со стороны липидов содержимое липидного шприца прогоняют обратно через смеситель в белковый шприц. Этот процесс повторяют многократно. Иногда для получения гомогенной смеси требуется сто и более проходов.

В начале перемешивания движение материала через соединитель может быть неравномерным, и иногда для обеспечения смешивания может потребоваться дополнительное усилие. Это является нормальным явлением. Первичное перемешивание обычно сопровождается появлением неоднородного помутнения в образце, что также является ожидаемым результатом.

По мере прохождения гомогенизации текстура, определяемая по усилию, необходимому для перемещения поршней вперед и назад, становится более однородной и характерной для вязкой кубической фазы, так же как и визуальный вид формирующейся кубической фазы. Если условия подобраны правильно и кубическая фаза образуется, дисперсия в цилиндре шприца должна стать оптически прозрачной.

Таким образом, деления на цилиндре шприца должны быть четко видны сквозь мезофазу в цилиндре. В случае использования окрашенных белков мезофаза будет иметь цвет белка, но останется оптически прозрачной. Незначительное охлаждение образца во время смешивания путем кратковременного помещения смесителя-шприца на лед может ускорить гомогенизацию и достижение прозрачности.

Однако важно не подвергать образец чрезмерному воздействию; следует избегать слишком интенсивного перемешивания, так как это может привести к повышению температуры образца из-за фрикционного нагрева. На данном этапе формируется кубическая мицеллярная фаза, и белок реконструируется в липидном бислое. Теперь мицеллярная фаза готова к дозированию в отдельные лунки кристаллизационных планшетов.

Однако сначала мезофазу необходимо перенести в шприц Hamilton объемом 10 µL, установленный в многоразовый дозатор. Начните этот процесс с закрепления шприца в дозаторе. Заполните шприц кубической мезофазой.

Извлеките иглу и поршень из шприца. Оставьте тефлоновую прокладку на месте. С помощью небольшой монеты снимите стопорную гайку с диспенсера.

При полностью отведенном рычаге храповика вставьте шприц без поршня и иглы через удерживающее кольцо диспенсера. Установите фиксирующий узел прокладкой в сторону шприца и плотно закрутите его на открытом конце шприца.

Следует убедиться, что шприц правильно центрирован в удерживающем кольце, а цилиндр расположен параллельно рычагу храповика. Оба этих условия можно проверить визуально. Соблюдение этих требований важно, так как в противном случае плунжер будет двигаться с трудом, что приведет к повышению давления в исходном шприце при загрузке и возможному возникновению утечек. Пропустите плунжер через зажимное кольцо, предварительно открутив зажимную гайку на несколько оборотов, и направьте плунжер в открытый конец шприца.

Полностью нажмите на рычаг храповика, чтобы переместить поршень в цилиндр, и убедитесь, что он свободно проходит по всей длине цилиндра. Если винт и направляющая перекладина были ослаблены, затяните их снова и повторно проверьте свободный ход поршня. Теперь дозирующий шприц готов к заполнению.

Переместите плунжер с одной стороны собранного смесительного устройства к нулевой отметке градуировки в микролитрах. Чтобы перенести мезофазу в другой шприц и соединитель, отсоедините пустой шприц с установленным UL от смесительного устройства и немедленно присоедините заполненный шприц с закрепленным соединителем к резьбовому наконечнику дозирующего шприца объемом 10 µL.

Степень плотности соединения при сопряжении имеет критическое значение. Как отмечалось ранее, заполните раздаточный шприц, нажав на поршень шприца объемом 100 µL таким образом, чтобы мезофаза переместилась через соединитель. Если соединение плотное и поршень раздаточного шприца движется свободно, то при заполнении раздаточного шприца его поршень должен начать перемещаться в том же направлении, что и поршень загрузочного шприца.

Отсоедините загрузочный шприц с прикрепленным соединителем от дозирующего шприца. Закрепите короткую иглу с плоским срезом на стальном наконечнике дозирующего шприца и аккуратно затяните ее. Зафиксируйте поршень на зубчатом рычаге, затянув узел на зажимном кольце.

Не следует затягивать узел слишком туго, так как это может привести к появлению царапин и деформации поршня, что сделает его непригодным для использования. Важно, чтобы диапазон перемещения рычага храповика в зажатом состоянии был ограничен одним дюймом.

Как показано далее, плунжер может иметь тенденцию к изгибу, что приведет к сбою подачи. Несколько раз нажмите на храповой барабан, чтобы продвинуть плунжер в цилиндре, заполняя тем самым свободный объем иглы и подготавливая её к подаче. Этот шаг следует повторить до 10 раз, пока из кончика иглы не выйдет непрерывная нить фазы меза.

Теперь игла готова к использованию для постановки экспериментов по кристаллизации, которые следует начать незамедлительно. Не рекомендуется хранить белок в кубической фазе слишком долго до начала постановки экспериментов. Поскольку некоторые белки нестабильны в кубической фазе без добавления осадителя, поместите многолуночный планшет для кристаллизации и покровное стекло на поверхность, приподнятую на несколько дюймов над столом для удобства загрузки.

Оптимальный контраст и повышенная видимость достигаются при слегка темном фоне поверхности. Гомогенизируйте растворы осадителя и снимите крышки с флаконов. Установите объем дозирования осадителя на 1 µL; удерживая дозирующий шприц вертикально в одной руке, другой рукой расположите кончик иглы в центре и непосредственно над дном лунки.

Шаг первый. Нажмите кнопку на повторяющемся дозаторе, чтобы вытеснить порцию реагента на стеклянную поверхность. Объем порции составляет 200 nanoliters.

При использовании стандартного репетитора с шприцем на 10 µL кончик иглы должен находиться не более чем в нескольких сотнях µm над дном лунки. Для обеспечения правильного дозирования легко добиться воспроизводимости; для этого потребуется лишь небольшая практика. После заполнения четырех соседних лунок белком mease нанесите по 1 µL раствора осадителя поверх каждого болюса mease.

Используя одноразовые наконечники объемом 2 µL, как можно быстрее перенесите содержимое в лунки, после чего аккуратно накройте заполненные лунки покровным стеклом, чтобы обеспечить равномерное и герметичное прилегание. С помощью шпателя прижмите покровное стекло в местах его контакта с липкой поверхностью разделительной ленты. Процесс дозирования образцов и преципитанта можно повторять до тех пор, пока все лунки на планшете не будут заполнены и загерметизированы.

Теперь планшет готов к осмотру и инкубации. Четко промаркируйте планшет для последующего отслеживания. При работе со светочувствительными белками планшеты обычно оборачивают алюминиевой фольгой перед помещением в инкубационную камеру.

Их можно извлечь и изучить под микроскопом при приглушенном или соответствующем по цвету освещении. Помещайте пластины в камеру с регулируемой температурой, обычно при температуре около 20 °C, с определенной периодичностью. Осматривайте стенки на предмет роста кристаллов с помощью поляризационного микроскопа с 10- или 20-кратным увеличением.

Цель: в лаборатории авторов используется следующий график: 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30-й дни после установки. Тщательно осмотрите болюс. Отрегулируйте глубину фокуса в образце толщиной 140 micron.

Осмотр следует проводить как при обычном освещении, так и между скрещенными поляризаторами; бесцветные кристаллы мембранных белков, выращенные в кубической фазе, при обычном освещении выглядят так. Бесцветные кристаллы мембранных белков, выращенные в мезофазе, при освещении поляризованным светом выглядят так или так, а естественно окрашенные мембранные белки, выращенные в мезофазе, при обычном освещении выглядят так или так.

Следующими этапами общего процесса определения структуры являются сбор и криоохлаждение кристаллов, а также запись и обработка данных рентгеновской дифракции. Эти темы рассматриваются в отдельных статьях JoVE данного цикла.