Мониторинг белка адсорбция с помощью полупроводниковых нанопор

Общая цель данной процедуры — создание нанопор в искусственных мембранах для использования в исследованиях абсорбции белков. Это достигается путем сверления нанопор в нитридной мембране с помощью зонда. Затем нанопора помещается в камеру и увлажняется ионным раствором.

Таким образом, жидкость образует мостик от одной стороны нанопоры к другой, подготавливая нанопору к проведению экспериментов. Между сторонами прикладывается напряжение, и можно наблюдать прохождение ионного тока через пору. Заключительным этапом является добавление белка в камеру с нанопорой.

Наблюдение длительных блокировок ионного тока через нанопору в конечном итоге свидетельствует об адсорбции белков на стенках нанопоры. Здравствуйте, я Дейв Уики, аспирант кафедры физики Сиракузского университета.

Хотя этот метод позволяет получить представление об адсорбции белков на неорганических поверхностях, он также может быть применен к другим системам, таким как взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами, спектроскопия одиночных молекул и изучение молекул в ограниченном пространстве. Начните с подачи ускоряющего напряжения на стержень.

Затем установите в держатель образцов ПЭМ сетку с окном из нитрида кремния SPI. Очистите сетку в кислородной плазме в течение 30 секунд для удаления загрязнений. Перед установкой образца поместите держатель в ПЭМ и дождитесь откачки воздуха для создания вакуума.

Используя режим ПЭМ в светлом поле, найдите нитридное окно, которое выглядит как яркий квадрат на исходной программе. Убедитесь, что ПЭМ выровнен правильно. Затем выполните юстировку и фокусировку образца.

Теперь переведите систему в режим STEM и используйте детектор hot off для получения изображения образца и проверки его центровки. Если в системе имеется монохроматор, установите его на низкое значение, чтобы увеличить ток электронов, доступный для сверления. Выберите соответствующий размер пятна для сверления нанопоры, исходя из диаметра электронного зонда.

После выравнивания стержня используйте программу BROGRAM, чтобы добиться идеальной фокусировки на нитридной мембране при требуемом увеличении. Если наблюдается любое смещение образца, перекройте электронный пучок и дождитесь стабилизации образца.

Этот процесс может занять до одного часа. После стабилизации установите электронный зонд на образец и начните сверление нанопоры. Сверление нанопоры с помощью ПЭМ требует предельного терпения.

Этот процесс представляет собой постепенное испарение нитрида под воздействием электронного пучка. Важно удерживать электронный пучок непосредственно над местом сверления и убедиться, что нанопора просверлена полностью. Перед извлечением образца из ПЭМ периодически проверяйте его, используя детектор с выключенным обтюратором (hot off detector).

Если образец немного сместится, отрегулируйте положение электронного зонда так, чтобы он находился над нанопорой. При фокусировке на ROI грам мерцающая нитридная пленка исчезнет. Когда нанопора формируется при расфокусировке roky грам, становится видна бахромчатая кромка гвоздя.

Снимите изображение нанопоры при выключенном нагревателе и постройте профиль интенсивности изображения. Диаметр нанопоры можно оценить по самой темной области профиля. При необходимости для расширения нанопоры можно использовать электронный пучок.

Когда будет достигнут необходимый диаметр, переключитесь в режим TEM с монохроматором в стандартном положении. Используйте ПЭМ в режиме светлого поля для подтверждения размера пор.

Начните с подготовки дегазированного физиологического раствора. Поместите раствор под вакуум и в ультразвуковую ванну на 20 минут. Осторожно поместите хрупкий чип с нанопорой из нитрида кремния в стакан из Pyrex объемом 10 мл. Затем в вытяжном шкафу установите стакан на нагревательную плитку.

Очень тщательно очистите чип Nanopore раствором пиранхи. Сначала с помощью стеклянной пипетки добавьте в контейнер три миллилитра серной кислоты. Затем осторожно добавьте к серной кислоте один миллилитр концентрированного перекиси водорода.

Пожалуйста, соблюдайте все меры предосторожности. Оставьте нанопоровый чип замачиваться на 10 минут. Затем с помощью стеклянной пипетки удалите раствор «пиранья» из стакана и утилизируйте его надлежащим образом.

Затем наполните стакан дегазированной деионизированной водой. Используя чистую стеклянную пипетку, опорожните стакан с водой и повторите эту промывку не менее пяти раз. С помощью чистого пинцета извлеките чип с нанопорами и высушите его с помощью легкого всасывания.

После высыхания немедленно закройте нанопоровый чип в камере. Чип можно зафиксировать в камере с помощью уплотнительных колец или силиконового герметика. Заполните камеру раствором хлорида калия.

Подключите серебряные электроды, покрытые хлоридом серебра, к камере. Электроды можно изготовить, выдержав серебряную проволоку в отбеливателе в течение ночи. Подайте трансмембранный потенциал на электроды и контролируйте токовый отклик с помощью патч-кламп усилителя.

В режиме фиксации потенциала постройте вольт-амперную характеристику на основе полученных измерений. График должен иметь выраженную линейность. При использовании одномолярного раствора хлорида калия проводимость нанопоры должна соответствовать ее диаметру.

Если нанопора не демонстрирует линейную ВАХ (вольт-амперную характеристику), это означает, что проводимость слишком низка или ток открытой нанопоры нестабилен. Это указывает на то, что нанопора закреплена неправильно, и процедуру промывки следует повторить. Крайне важно убедиться, что внутри нанопоры находится жидкость.

Если этот этап будет выполнен неправильно, ионный ток через нанопору будет характеризоваться очень высоким уровнем шума, а количество белков, проходящих через нанопору, резко сократится. Начните с добавления очищенного образца исследуемого белка в заземленную ванну камеры. Дождитесь полной диффузии образца.

Приложите смещение трансмембранного потенциала с полярностью, противоположной общему заряду исследуемого белка. Приложенного потенциала 200 millivolts должно быть достаточно для наблюдения. Большинство событий с анализируемыми белками будут проявляться в виде переходных отклонений тока от базовой линии.

Если сигнал отсутствует, увеличьте концентрацию белка в камере. Более высокое напряжение улучшает соотношение сигнал/шум и проводимость нитрида. Нанопоры способны выдерживать напряжение в несколько вольт.

Адсорбция белков будет проявляться в виде длительных изменений базового тока нанопоры. Типичные результаты для твердотельных нанопор будут следующими. Ток открытой поры должен быть высокостабильным.

ВАХ нанопоры должна быть высоколинейной. В растворе 1 M KCl и 10 M калий-фосфатного буфера с pH 7.4 наклон линейной аппроксимации кривой ВАХ позволит определить единичную проводимость нанопоры. Проводимость находится в прямой зависимости от диаметра нанопоры и должна соответствовать уравнению.

Это значение должно совпадать с точностью до 30%. Если значение слишком мало, вероятно, пора не связана с добавлением белка. Быстрые события должны следовать за тем, как абсорбция белка вызывает длительное падение тока. Некоторые белки очень лабильны и претерпевают структурную трансформацию внутри поры.

В данном случае длительное падение напряжения будет сопровождаться быстрыми колебаниями. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать твердотельные нанопоры с помощью сканирующего просвечивающего электронного микроскопа и использовать их для адсорбции белков SA. Не забывайте, что работа с раствором «пиранья» может быть крайне опасной, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в вытяжном шкафу с использованием перчаток, лабораторного халата и химического фартука.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.