Оценка раковых стволовых клеток миграции с помощью Compartmentalizing микрофлюидных устройств и изображений живых клеток

Общая цель данной процедуры заключается в визуальном осмотре и характеристике миграции раковых клеток через разделительное микрофлюидное устройство. Это достигается путем предварительной диссоциации уже сформированных нейросфер стволовых клеток опухоли головного мозга, выращенных в безсывороточной среде. Вторым этапом является изготовление двухслойной мастер-формы из SU-8 и с помощью мягкой литографии — PDMS-штампа с разделительной структурой.

Затем соберите микрофлюидное устройство и загрузите в него стволовые клетки опухоли головного мозга. На заключительном этапе с помощью универсальной микроскопической системы проводится длительная таймлапс-визуализация миграции стволовых клеток опухоли головного мозга. В конечном итоге результаты показывают, что стволовые клетки опухоли головного мозга проходят через повторяющуюся последовательность морфологических стадий в процессе миграции через ультраограниченное пространство.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими аналогами, такими как камеры Бойтона Transwell, является то, что микроустройство позволяет проводить визуальный контроль процесса миграции, контролируемое размещение клеток и точную доставку факторов. Таким образом, технология микрофлюидики обладает характеристиками надежного, эффективного и экономичного отбора и навигации отдельных клеток. Применение данного метода распространяется на терапию метастазов и рецидивов рака, поскольку анализ отдельных высокоподвижных клеток может помочь в выявлении потенциальных мишеней для будущей химиотерапии.

Хотя этот метод позволяет изучить особенности миграции в раковых системах, его также можно применять к другим системам, таким как эмбриональное развитие, иммунные ответы, заживление ран и регенерация органов. Начиная с клеточной суспензии нейросфер, полученных из BTSC. Соберите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте их при 900 RPM в течение пяти минут, не превышая указанную скорость.

Оспирируйте супернатант. Затем дайте нейросферам разрыхлиться, инкубируя их в 0,5 мл предварительно подогретого Accutane в течение 5–10 минут при 37 °C. После инкубации механически диссоциируйте клетки, аккуратно пропипетировав их 10–20 раз с помощью дозатора P100.

Затем добавьте 1,5 мл среды для стволовых клеток, чтобы нейтрализовать Accutane, центрифугируйте клеточную суспензию при 1300 об/мин в течение пяти минут и ресуспендируйте клетки в одном мл среды для стволовых клеток. Проверьте плотность клеток с помощью гемоцитометра и доведите плотность до 20 000 клеток на мкл. Для начала изготовления мастер-формы из SU-8 подготовьте две фотошаблона с помощью Adobe Illustrator и прозрачной пленки для лазерной печати с использованием системы Image Setter.

Первый слой фотошаблона состоит из двух реперных меток и массива микроканалов, а второй слой фотошаблона содержит посадочные и приемные камеры. Очистите оба слоя шаблона изопропанолом и дайте им высохнуть на воздухе. Затем нанесите на подложку методом центрифугирования слой фоторезиста SU-8 толщиной 3 мкм с последующим мягким запеканием.

Затем при плотном контакте с фотошаблоном первого слоя подвергните фоторезист воздействию УФ-излучения и дайте ему отвердеть. После этого проведите допекание и проявление отвержденной пластины. Заклейте области с реперными метками на поддерживающей пластине клейкой лентой.

Затем нанесите на пластину фоторезист толщиной 250 micron методом центрифугирования. После этого снимите ленту, чтобы обнажить метки, необходимые для совмещения. Нанесите второй слой фоторезиста и совместите реперные метки.

Затем подвергните вторую маску фотошаблона УФ-облучению и отверждению, после чего проведите допекание и проявление. Теперь обработайте мастер из SU-8 методом газофазного осаждения для уменьшения липкости поверхности. Поместите пластины в эксикатор с несколькими каплями раствора трихлорэтилена под вакуумом минимум на один час.

После этого матрица будет готова для формования PDMS. Начните с тщательного смешивания основы prepolymer с отвердителем в соотношении 10:1. Затем поместите смесь в эксикатор для вакуумного дегазирования до полного исчезновения пузырьков воздуха.

Вылейте смесь на маску и снова удалите пузырьки воздуха. Если появились новые пузырьки, подвергните форму отверждению на горизонтальном нагревательном планшете в течение двух часов при 90 °C. После охлаждения до комнатной температуры осторожно отделите штамп из PDMS.

Таким образом, каналы для культивирования выгравированы в PDMS, и микрофлюидное устройство готово к сборке. Матрицу можно использовать повторно для формования до тех пор, пока она не треснет или не износится. Если матрица становится липкой, антиадгезионное покрытие можно нанести повторно.

Начните с создания входных и выходных отверстий в микрофлюидном устройстве с помощью штампа из PDMS. С помощью прокола для биопсии очистите штамп из PDMS, выдержав его в 70% ethanol в течение 30 минут, а затем промыв деионизированной водой в течение 10 минут. Стерилизуйте штамп из PDMS и завершите реакции сшивания путем автоклавирования.

Теперь поместите штамп из PDMS на предметное стекло, покрытое поли-L-лизином. Затем устройство покрывают ламинатом, заполняя камеры раствором ламината через входные отверстия резервуаров, и инкубируют в течение ночи при 37 °C. На следующий день аспирируйте ламинат из устройства.

Затем промойте устройство, дважды заполнив его средой для культивирования стволовых клеток. Теперь внесите 11 µL диссоциированных клеток в один из резервуаров для посева. При необходимости используйте вакуумную аспирацию, чтобы переместить клетки в камеру. Затем внесите еще 7 µL клеток в соседний резервуар для посева.

Через пять минут посадочные и приемные резервуары будут заполнены средой. Теперь поместите на устройство стерильный лист PDMS толщиной от 0,5 до 1 мм. Естественная поверхностная адгезия PDMS к самому себе обеспечит герметизацию устройства; после этого оно будет готово к транспортировке, инкубации и микроскопической визуализации.

Предварительно уравновесьте биостат IM, запустив его на 45 минут. Чтобы стабилизировать температуру, влажность и подачу воздуха, добавьте в камеру для образцов несколько чашек с водой для достижения надлежащего уровня влажности. Поместите подготовленное устройство в камеру для образцов микроскопа.

Центрируйте устройство с помощью микропинцета. Теперь с помощью программного обеспечения Biot установите точки фокусировки и временные интервалы, и, если необходимо, запустите запись таймлапса. Через пять дней культивирования замените питательную среду.

Процесс перемещения BTC, посеянных в устройство, непрерывно регистрировали с помощью фазово-контрастной микроскопии. В течение пяти дней в камере размещения веретенообразные клетки находились на предмиграционной стадии. По мере приближения к входу в микроканал некоторые клетки расширялись и формировали адгезивные выросты.

Только одна клетка могла занять вход и определить направление миграции. Как только клетка определяла направление миграции, она начинала движение через весь микроканал с постоянной высокой скоростью. В конце микроканала клетка исследовала открытое пространство приемной камеры, прежде чем окончательно войти в нее.

При наблюдении за клетками с двумя интервалами повторной визуализации оказалось, что движущая сила создается преимущественно за счет активности, напоминающей «блаббинг» (blabbing), которая характерна для клеток OID. При выполнении данной процедуры важно помнить, что конструкция устройства достаточно гибкая, и размеры микроканалов можно изменять для достижения желаемой степени миграции клеток. После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как создать уникальное разделительное микрофлюидное устройство, подходящее для культивирования интересующих вас клеток, а затем провести длительную таймлапс-визуализацию для качественного и количественного определения миграционных характеристик этих клеток в соответствии с данной процедурой.

Другие методы, такие как секвенирование следующего поколения или микрочиповый анализ ДНК, могут быть применены для поиска ответов на дополнительные вопросы, например, о степени генетического различия высокоподвижных раковых клеток.