Пример подготовки

Целью данной процедуры является анализ бесклеточных экстрактов Mycobacterium tuberculosis с помощью ЯМР-метаболомики: сначала проводят культивирование и сбор клеток на соответствующей стадии роста, затем лизируют клетки для получения бесклеточных экстрактов для анализа. Лиофилизированные экстракты ресуспендируют в буфере для анализа методом ЯМР.

Наконец, соберите данные ЯМР и проанализируйте спектры с помощью программного обеспечения для идентификации метаболитов. В конечном счете, ЯМР-анализ mycobacterium tuberculosis используется для демонстрации сохранения уровней метаболитов при различных воздействиях. ЯМР-метаболомика может быть применена к ключевым аспектам физиологии mycobacterium tuberculosis, таким как важные метаболические пути.

Это понимание имеет решающее значение для выяснения механизмов действия лекарственных средств и развития резистентности, а также для поиска новых мишеней при разработке препаратов. Как правило, лица, впервые применяющие данный метод, могут столкнуться с трудностями из-за невозможности обеспечить абсолютно идентичную обработку всех образцов, что приведет к возникновению ненужной вариабельности результатов в моей лаборатории. Стивен Лука, PhD, аспирант, продемонстрирует процедуры подготовки образцов для ЯМР-анализа в моей лаборатории, а затем менеджер исследовательской лаборатории и Роберт Фентон, исследователь-техник в третьей степени, продемонстрируют процедуры работы с культурами Mycobacterium tuberculosis при проведении исследований M. tuberculosis.

Исследование проводилось с соблюдением правил третьего уровня биобезопасности согласно внутренним инструкциям учреждения. Хотя из соображений биобезопасности на этикетках в данном видео указано microbacterium tuberculosis, в этой демонстрации использовался непатогенный штамм mycobacterium magmatic. Начните с размораживания на льду стока M tuberculosis в 50% глицероле.

Внесите 0,15 мл в 110 мл бульона M-A-D-C-T-W в колбу Эрленмейера объемом 250 мл и культивируйте культуры при 37 °C с перемешиванием при 100 RPM в течение примерно шести дней. Если требуются антибиотики, альтернативные добавки или иная обработка, проведите их. Соберите культуры, требующие обработки.

Отберите 0,5 миллилитра Eloqua и поместите на лед для использования при культивировании, титровании и контроле качества. Затем проведите необходимую обработку и после завершения времени воздействия верните культуры в шейкер. Отберите один миллилитр и определите OD 600.

Также отберите пробу объемом 0,5 мл для культивирования, титрования и контроля качества. На протяжении всего оставшегося протокола держите клетки на льду. Соберите клетки в четыре пробирки по 50 мл путем центрифугирования после промывки 15 мл ледяной дважды дистиллированной воды.

Риз ресуспендирует осадок в аликвотах по 10 milliliter. Отрабатывают две аликвоты и осаждают клетки центрифугированием, затем ресуспендируют клеточный осадок в конечном объеме 1 milliliter дважды дистиллированной воды. Если требуется суспензия одиночных клеток без агрегатов, клетки пропускают через иглу 27 gauge.

Трижды перенесите по 1 mL клеточной суспензии в пробирки объемом 2 mL с завинчивающейся крышкой, содержащие лизирующий матрикс B. Поместите гомогенизатор для лизиса Fast Prep 24 в шкаф биологической безопасности. Поместите образцы в держатель, закрепив их пластиной с фиксирующими спицами. Затем проведите обработку в течение 60 секунд при установленной скорости 6 m/s.

Затем центрифугируйте образцы для осаждения клеточного дебриса и целых клеток. После этого пропустите супернатант через шприцевой фильтр с размером пор 0.2 micron в стерильную пробирку, чтобы подтвердить отсутствие жизнеспособных клеток. Высейте 0.1 milliliter образца на MADC.Agar.

Заморозьте образцы в смеси этанола и сухого льда и храните при температуре -80 °C до момента их лиофилизации и анализа на установке ЯМР. Через два месяца проверьте планшеты, чтобы подтвердить отсутствие колониеобразующих единиц. Если КОЕ не обнаружены, образцы можно вынести из лаборатории уровня BSL-3 для дальнейшего анализа в стандартной лаборатории ЯМР.

После высушивания образцов досуха ресуспендируйте их в 0,7 milliliters ЯМР-буфера и перенесите в микроцентрифужную пробирку; центрифугируйте в течение трех минут при 13 000 ×g. Отоберите 0,6 milliliters и перенесите в 5-миллиметровую ЯМР-трубку. Для анализа среды используйте специальную стойку, которая облегчает загрузку нескольких ЯМР-трубок в спиннеры на нужную глубину.

Затем перенесите образцы в ЯМР-спектрометр для установки в автосамплер A-B-A-C-S на 20 образцов, чередуя необработанные культуры и культуры, подвергшиеся воздействию препарата. Первый образец должен быть предварительно загружен в магнит перед началом автоматического запуска.

Для калибровки прибора оптимизируйте длительность 90-градусного импульса на одном образце, после чего настройте прибор для остальных образцов. Используйте иконки NMR и grad shim. Автоматизируйте процессы запирания, шиммирования и сбора данных ЯМР для каждого образца.

Для получения одномерного спектра ЯМР ¹H выберите импульсную последовательность с подавлением сигнала воды и методом excitation sculpting. Для получения двумерного спектра ¹H-¹³C HSQC установите общее количество точек данных 32 000, 128 сканирований и 16 фиктивных сканирований. Выберите соответствующую импульсную последовательность.

Выберите в общей сложности 2048 точек данных с шириной сканирования вдоль прямого измерения H one и 64 точки данных с шириной сканирования вдоль непрямого измерения C 13. Также укажите сбор спектров с 128 сканированиями и 16 холостыми сканированиями для получения хорошего соотношения сигнал/шум. Спектр m tuberculosis содержал приблизительно 400 пиков, включая 50 известных метаболитов.

Например, обработка данных, подробно описанная в сопроводительной рукописи, позволила получить этот спектр метаболитов, которые прямо или косвенно связаны с путем D-аланина. Величина интенсивности пиков пропорциональна концентрациям метаболитов в клеточном экстракте, поэтому можно количественно оценить относительные изменения метаболитов и метаболических путей между различными образцами и вариантами обработки. Метаболомика с использованием LMR открывает перед исследователями в области бактериологии возможности для изучения физиологии и патогенеза визуально и микробиологически в отношении других патогенных или непатогенных микроорганизмов.

После просмотра данного видео вы должны будете четко понимать, как подготовить несколько экстрактов клеток возбудителя туберкулеза для метаболомного анализа методом ЯМР, и, что немаловажно, как обеспечить единообразие на всех этапах протокола для получения достоверных результатов.