Сайт-специфическая бактериальная хромосома Инженерно: ΦC31 интегразы опосредованная кассеты бирже (IMCE)

Общая цель данного эксперимента заключается в интеграции желаемой конструкции ДНК в хромосому бактерии в заранее определенном локусе. Это достигается с помощью протокола спаривания с использованием четырех модифицированных штаммов бактерий. Реципиентный штамм содержит интегрированную в хромосому последовательность «посадочной площадки», состоящую из гена устойчивости к специмицину и гена бета-глюкуронидазы e coli, фланкированных сайтами ATP.

Донорский штамм P JH one 10 несет плазмиду, содержащую сайты B, фланкирующие ген-заглушку красного флуоресцентного белка, и ген устойчивости к антибиотикам. Донорский штамм PJC two несет плазмиду, содержащую сайт-специфическую интегразу фага C 31 Streptomyces под контролем промотора LAC. Четвертый штамм MT 616 обеспечивает гены переноса, необходимые для конъюгации — переноса плазмид из клетки в клетку, что приводит к созданию трансгенных реципиентных штаммов.

Получение двух плазмид, необходимых для обмена кассет с помощью интегразы. Обмен донорской кассеты плазмиды PJ H one 10 с маркерами кассеты «посадочной площадки» (landing pad) в хромосоме приводит к потере маркеров посадочной площадки SPR и UIDA и сохранению маркеров донорской кассеты RFP и GMR в полученном транс-иммигранте. Основным преимуществом данной методики перед другими способами, такими как гомологичная рекомбинация, является простота и эффективность протокола.

Данный метод также применим к широкому спектрому бактерий. Акцепторным штаммом, используемым в данном видео, является штамм S. mille latte. За два дня до процедуры спаривания для создания транс-интегринов пересейте одну колонию в 5 мл среды TY со спектномицином; инкубируйте штамм S. mille при 30 °C в течение двух дней с перемешиванием. За день до процедуры спаривания пересейте следующие штаммы E. coli в 5 мл жидкой среды LB с соответствующим антибиотиком: DH5α, содержащий плазмиду экспрессии интегразы, в среду с тетрациклином; MT616 (мобилизатор) в среду с хлорамфениколом; и DH5α, содержащий плазмиду донорской кассеты, в среду с гентамицином. Инкубируйте три штамма E. coli в течение ночи при 37 °C с постоянным перемешиванием. Для подготовки клеток к процедуре спаривания перенесите по 1,5 мл каждой из четырех культур в пробирки и центрифугируйте при 17 000 ×g в течение 30 секунд для осаждения клеток. Удалите среду и ресуспендируйте каждый осадок в 1 мл стерильного 0,85% раствора NaCl. Снова центрифугируйте пробирки, после чего удалите супернатант. Ресуспендируйте каждый осадок в 100 µL стерильного 0,85% раствора NaCl. С помощью пипетки нанесите по 10 µL промытой культуры каждого штамма отдельными пятнами на чашку с обычным агаром TY.

Эти пятна являются контрольными. Затем добавьте по 40 мкл каждого штамма, за исключением e coli DH5α, содержащего Pjc2, в стерильную пробирку и перемешайте, несколько раз прокачав жидкость через наконечник пипетки; нанесите 120 мкл этой смеси на чашку с обычным TY-агаром. Это пятно служит отрицательным контролем без интегразы.

Наконец, добавьте по 40 мкл каждого из четырех штаммов в стерильную пробирку, перемешайте и нанесите 160 мкл этой смеси на ту же чашку с агаром TDY. Эта точка представляет собой точку спаривания для обмена кассет, опосредованного интегразой.

Поместите планшет в ламинарный шкаф и дайте пятнам высохнуть в течение примерно 20 минут. Герметично закройте планшет и инкубируйте при 30 °C в течение ночи после проведения протокола спаривания и пересева. Перенесите два контрольных пятна и пятно спаривания IMCE на чашки с агаром TY, дополненным стрептомицином и гентамицином.

Штамм-акцептор S milli несет мутацию, обеспечивающую высокий уровень устойчивости к стрептомицину, что необходимо для расчета эффективности IMCE. Ресуспендируйте примерно одну четверть пятна спаривания IMCE в 500 µL стерильного 0,85% раствора NaCl. Приготовьте десятикратные серийные разведения до 10⁻⁷. Высейте разведения от 10⁻² до 10⁻⁵ на чашки с агаром TY, содержащим стрептомицин, гентамицин и xgl, для отбора трансмигрантов. Высейте разведения от 10⁻³ до 10⁻⁷ на чашки с агаром TY, содержащим стрептомицин и xgl, для отбора как трансмигрантов, так и потенциальных реципиентов. Инкубируйте чашки при 30 °C в течение трех дней.

Просмотрите RFP trans под зеленым светом и через красный фильтр; рассчитайте процент эффективности IMCE как отношение КОЕ транс-иммигрантов к КОЕ всех реципиентов. Примерно половина транс-иммигрантов подвергнесь истинному обмену, в результате чего через три дня инкубации на среде Ty с добавлением стрептомицина и гентамицина они станут белыми и нечувствительными. Роста не должно быть у следующих контрольных штаммов: контроль по интегразе s milli latte UW 2 27, контроль e coli MT 616, контроль e coli DH five alpha с плазмидой P JH one 10 и контроль e coli DH five alpha с плазмидой PJC two. Напротив, при посеве IMCE из пятна спаривания должен наблюдаться слитный рост на основном штрихе и множество колоний на втором штрихе. Следующие два изображения демонстрируют ресуспензии разведения 10⁻² пятна спаривания на агаре TY стрептомицин xgl и на агаре TY стрептомицин гентамицин xgl.

Синие колонии представляют собой одиночные рекомбинанты. В то время как белые колонии являются транс-интегранами, которые подверглись истинному обмену кассетами при просмотре под зеленым светом и через красный фильтр, разведение 10⁻² суспензии для спаривания на агаре TY с добавлением стрептомицина, цина и Xgl не проявляет флуоресценции. Напротив, разведение 10⁻² суспензии для спаривания на агаре Ty с добавлением стрептомицина, гентамицина и Xgl демонстрирует два уровня флуоресценции.

Более яркие колонии соответствуют синим колониям и характеризуются более высокой экспрессией RFP, что, вероятно, обусловлено сквозным считыванием с LAC-промотора в векторе. Менее яркие колонии соответствуют белым колониям, в которых произошел истинный обмен кассет; они содержат RFP только с его непосредственным промотором, без сквозного считывания с LAC-промотора. Согласно этим закономерностям, такие колонии также должны быть чувствительны к специмицину.

Эффективность транс-интеграции, выраженная как процент транс-иммигрантов от общего числа реципиентов, должна находиться в диапазоне 0,5%. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать бактериальную конъюгацию с помощью наших сконструированных штаммов для вставки ДНК-конструкций в бактериальную хромосому.