Методы Анализ Drosophila Поведение
7 марта 2012 г.
DROSOPHILA MELANOGASTER является генетически и поведенчески послушный модели системы, которая была использована, чтобы понять молекулярные и клеточные основы многих важнейших биологических процессов на протяжении более века 1. Дрозофилы было хорошо использовали, чтобы получить понимание генетической основы лету поведения.
Общая цель данной процедуры — продемонстрировать методы исследования двигательных, сенсорных функций и координации поведения дрозофил. Это достигается путем последовательной оценки двигательной функции личинок с помощью анализа ползания, оценки двигательной функции взрослых особей с помощью кольцевого теста, а также оценки координации и сенсорных способностей взрослых особей с помощью анализа ухаживания. В конечном итоге данный набор поведенческих тестов позволяет показать, как генетические и внешние факторы, такие как прием лекарственных препаратов, могут влиять на активность и координацию.
Intra sophala. Основным преимуществом данного анализа по сравнению с существующими методами, такими как negative geo axis, является более высокая пропускная способность и чувствительность кольцевого анализа. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейродегенеративных заболеваний, такие как раннее выявление двигательных нарушений.
Этот метод продемонстрирует доктор Джейми Бекнелл, постдок моей лаборатории. Тест на ползание личинок используется для измерения влияния генетических и средовых факторов на подвижность; для начала подготовки скрестите от 10 до 15 самцов и от 10 до 15 неспаривающихся самок в стандартном флаконе. Через 24 часа здоровые взрослые особи отложат достаточное количество яиц, чтобы заселить флакон, при этом данная популяция будет иметь одинаковый возраст — 24 часа.
Перенесите взрослых особей в новый флакон и повторите этот процесс. Теперь инкубируйте флакон до появления личинок третьей стадии в корме во флаконе. Добавьте 50–100 мл 20% сахарозы и оставьте на 20 минут.
Личинки всплывут на поверхность; соберите их с помощью серологической пипетки объемом 25 milliliter с обрезанным кончиком и поместите в сетчатую корзину. Промойте личинок в сетчатой корзине дважды деионизированной водой. Теперь с ними можно проводить эксперименты.
Для обработки личинок препаратом с помощью кисти перенесите необходимое количество личинок в стакан объемом 5 мл, содержащий раствор 5% sucrose и исследуемый препарат. Позвольте им питаться сахарным раствором с препаратом в течение 15 минут, затем вылейте их обратно через сетчатую корзину, промойте и приступайте к измерению влияния препарата на подвижность. С помощью кисти перенесите отдельную личинку в чашку Петри диаметром 15 см, содержащую 2% agarose.
Поместите поверх листа миллиметровки. Теперь соберите данные. Просто подсчитайте количество линий сетки, которые пересечет лава за одну минуту.
Затем с помощью кисточки перенесите личинку в лунку стеклянного диссекционного блюда, содержащего разбавленный раствор дрожжевой пасты; под диссекционным микроскопом в течение одной минуты подсчитайте количество сокращений тела личинки. Одним сокращением считается полное движение от заднего конца к переднему. Повторяйте процедуру до тех пор, пока не будет подсчитано нужное количество личинок.
Протокол с использованием кольцевой арены позволяет измерить скорость передвижения взрослых особей. Соберите недавно окуклившихся взрослых самцов мух под легкой анестезией и перенесите их в стандартный флакон, содержащий обычный или модифицированный лекарственным средством корм. Поместите в каждый флакон примерно 25 мух. Содержите мух при комнатной температуре в течение двух-трех дней для полного восстановления после анестезии и достижения стационарной концентрации препарата в организме.
Затем перенесите около 25 мух без использования анестезии в полистирольные флаконы с литыми пробками и установите флаконы в один или несколько кольцевых аппаратов. Дайте мухам отдохнуть в течение 15–20 минут, в это время настройте цифровую камеру для фотографирования флаконов сбоку; подготовьте таймер и установите его на необходимую длительность теста. Обычно для проведения теста требуется три секунды.
Удерживая кольцевой аппарат в одной руке, стараясь не беспокоить мух, и таймер камеры в другой, резко постучите аппаратом по лабораторному столу три раза, чтобы сбить мух, одновременно запустив обратный отсчет таймера камеры. Повторяйте этот опыт одну сторону в минуту, пока не будет выполнено пять или шесть попыток.
Крайне важно не использовать повторно полистирольные пробирки для тестирования после сбора первичных наборов данных. Это связано с тем, что новые мухи, помещенные в использованные пробирки, не будут подниматься на ту же высоту, что и мухи в новых пробирках. Чтобы собрать данные с помощью программы для просмотра изображений, оцените среднюю высоту подъема для каждой из групп.
Для данного анализа требуются подготовленные генетические скрещивания в бутылях с обильным потомством для сбора мух. В течение нескольких часов после субъективного рассвета животных очистите бутыли, собирая всех взрослых особей с интервалом в три-четыре часа. Соберите недавно вылупившихся полово незрелых самцов и самок; разместите самцов индивидуально в виалах или пробирках с кормом, а самок — группами по пять-шесть особей.
Для проведения анализа в аналогичные контейнеры необходимо поместить равное количество самцов и самок. После изоляции собранных мух в течение пяти дней подготовьте их к помещению в спаривательное колесо и проведите анализ. Затем с помощью диссекционного микроскопа аккуратно перенесите одну самку и одного самца в камеру спаривательного колеса.
Наблюдайте за парой в течение 10 минут или до момента успешного спаривания в этот период. Зафиксируйте время первого проявления каждого из нескольких типов поведения. Запишите, когда самец впервые повернулся к самке.
Зафиксируйте момент, когда самец впервые касается самки лапкой; зафиксируйте, когда самец впервые расправляет и вибрирует крылом; зафиксируйте, когда самец впервые слизывает секрет с гениталий самки; зафиксируйте, когда самец впервые подгибает брюшко под себя. Зафиксируйте момент первой попытки самца запрыгнуть на самку. В завершение зафиксируйте общее время, затраченное на брачное поведение до момента начала копуляции.
Для животных дикого типа это почти всегда происходит в течение пяти-10 минут; данные собираются по трем различным параметрам. Во-первых, латентный период поведения — это время до его первого проявления. Во-вторых, частота поведения определяется тем, наблюдается ли оно или нет.
В-третьих, индекс ухаживания представляет собой отношение времени, затраченного на ухаживание, к общему времени до начала копуляции в эксперименте с животными. Мутации в гене F-U-S-T-L-S связаны с боковым амиотрофическим склерозом. Мутанты с центральной инсерцией продемонстрировали способность к ползанию в два раза ниже, чем у контрольной группы дикого типа (слева), а миссенс-мутация R 5 21 C снизила скорость ползания всего до одного сантиметра в минуту.
Кольцевой тест молодых взрослых мух дикого типа показал среднюю высоту подъема от трех до пяти сантиметров за трехсекундный интервал. В данном анализе не наблюдалось десенсибилизации вплоть до пяти последовательных попыток с интервалом в одну минуту. При проведении кольцевого теста важно максимально точно соблюдать временные интервалы.
При должном навыке и правильном выполнении тест на скученность личинок занимает от 30 до 40 минут для наблюдения за 10 попытками одного генотипа. После просмотра этого видео вы также должны получить четкое представление о том, как наблюдать и оценивать поведение мух при ухаживании.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлены методы исследования моторных сенсорных функций и координации поведения Drosophila. В исследовании используются различные тесты для оценки двигательной функции и координации, что позволяет получить представление о генетических и внешних факторах, влияющих на эти особенности поведения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Поведенческая биология
- Генетика
Теоретическая часть
- Drosophila melanogaster является широко используемым модельным организмом.
- Она внесла значительный вклад в понимание биологических процессов.
- Генетические основы поведения мух были подробно изучены.
- Поведенческие тесты позволяют получить ценные сведения о нейродегенеративных заболеваниях.
Цель исследования
- Продемонстрировать методы оценки моторных функций Drosophila.
- Оценить влияние генетических и внешних факторов на поведение.
- Предложить более высокопроизводительную и чувствительную альтернативу существующим методам анализа.
Используемые методы
- Тест на ползание для оценки моторной функции личинок.
- Кольцевой тест для оценки моторной функции взрослых особей.
- Тест на ухаживание для оценки координации и сенсорных способностей взрослых особей.
- Сравнение новых тестов с традиционными методами.
Основные результаты
- Метод с использованием кольца обеспечивает более высокую пропускную способность и чувствительность.
- Поведенческие тесты позволяют выявить локомоторные дефекты на ранних стадиях.
- Генетические модификации и фармакологическое воздействие влияют на активность и координацию Drosophila.
- Полученные данные могут быть использованы в исследованиях нейродегенеративных заболеваний.
Выводы
- Тесты на Drosophila эффективны для изучения моторного и сенсорного поведения.
- Данные методы позволяют углубить понимание генетического влияния на поведение.
- Результаты этих исследований могут быть использованы в дальнейших работах по изучению нейродегенеративных заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Надежные поведенческие тесты на Drosophila позволяют на ранних этапах исследовать генетические и фармакологические эффекты, влияющие на двигательные функции и координацию, что повышает прогностическую достоверность моделей нейродегенеративных и других патологических заболеваний. Высокопроизводительные количественные показатели ползания личинок, способности взрослых особей подниматься вверх (RING) и тесты на поведение при ухаживании способствуют быстрой проверке гипотез и снижению механистических рисков в критических точках этапа поиска новых мишеней. Эти методы служат основой для сортировки портфеля препаратов, обеспечивая масштабируемые и воспроизводимые данные для валидации мишеней и скрининга соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет проводить функциональную оценку генетических нарушений и влияния лекарственных препаратов на двигательное поведение.
- Обеспечивает механизм снижения рисков путем количественного определения фенотипических результатов в релевантных моделях заболеваний.
- Способствует быстрому отбору мишеней на основе воспроизводимых поведенческих конечных точек.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированные высокопроизводительные поведенческие тесты для масштабируемой оценки соединений.
- Предоставляет количественные стандартизированные результаты для сравнения различных условий.
- Снижает вариабельность анализа и повышает воспроизводимость при проведении скрининговых кампаний.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет поведенческие фенотипы с трансляционными конечными точками, актуальными для моделей нейродегенеративных заболеваний.
- Обеспечивает непрерывность процесса от генетического открытия до доклинической валидации функциональных результатов.
- Поддерживает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков на основе ранних поведенческих показателей.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данные поведенческие тесты позволяют рассматривать Drosophila как универсальную платформу — от этапа первичного поиска до идентификации ведущих соединений и доклинических исследований, обеспечивая бесшовную интеграцию генетических, фармакологических и фенотипических данных.
- Биологические исследования: Количественные поведенческие тесты обеспечивают проверку гипотез и проясняют взаимосвязи между генами и их функциями.
- Скрининг: Высокопроизводительные тесты на формирование колец (RING) и ползание представляют собой воспроизводимые масштабируемые платформы для скрининга соединений и генетических модификаций.
- Аналитика: Стандартизированные измерения (например, высота подъема, скорость ползания, индекс ухаживания) позволяют проводить надежное статистическое сравнение различных генотипов и вариантов воздействия.
- Трансляционные исследования: Поведенческие конечные точки соответствуют фенотипам, релевантным для конкретных заболеваний, что способствует разработке трансляционных биомаркеров.
- Корпоративное использование: Методики анализа адаптируемы для различных генетических линий и типов лекарственных средств, что позволяет применять их в широком спектре портфельных проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизирует поведенческое фенотипирование для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости исследований.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и осуществлять экономически эффективное управление портфелем.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение мишеней и соединений, имеющих значение для конкретных заболеваний.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области генетики и поведенческого фенотипирования Drosophila.
- Необходим доступ к оборудованию для визуализации и стандартизированной инфраструктуре для проведения анализов.
- Требуется строгая стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости результатов.
- Протоколы анализа должны быть адаптированы под конкретные генетические линии или схемы применения препаратов.
- Потенциальные ограничения включают чувствительность к переменным факторам окружающей среды и ограничения пропускной способности анализа при проведении крупномасштабных скринингов.
