Простой способ измерить изменения в Reward обращаемость за помощью

Общая цель данной процедуры — измерение самовведения этанола плодовыми мушками в качестве индикатора изменений в состоянии системы вознаграждения. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы нейробиологии, например, о том, как опыт кодируется в мозге и приводит к модификации поведения. Основным преимуществом данной методики является ее относительная простота и отсутствие необходимости в сложном оборудовании.

Протокол состоит из двух отдельных частей. Первая заключается в воздействии на мух стимулирующих (поощряющих) и нестимулирующих факторов, а вторая — в анализе добровольного потребления этанола как показателя мотивации к получению наркотического вознаграждения. Эти две части протокола могут использоваться независимо друг от друга.

Для индукции модуляции опыта в качестве начального этапа перед последующими анализами или в качестве независимого теста по кормлению с выбором из двух вариантов. Процедуру продемонстрируют Шир Зер, магистрант, и Юлия Ревкин, аспирант, обе из моей лаборатории. Чтобы приступить к сборке капиллярной кормушки, сначала возьмите стандартный флакон для мух с мелкими отверстиями по бокам.

С помощью лезвия бритвы разрежьте пробку флакона пополам поперек. Отметьте на поверхности пробки четыре точки в форме квадрата для размещения держателей капилляров. С помощью иглы 18-го калибра проделайте в пробке четыре отверстия в местах отметок.

Затем расширьте отверстия с помощью микропипетки. С помощью лезвия бритвы обрежьте четыре микропипетки так, чтобы в них плотно фиксировались стеклянные капилляры объемом 5 µL. Вставьте их в отверстия в подготовленной пробке.

Отметьте на пробке положение двух капилляров, в которых будет находиться этанол. Затем расставьте стеклянные флаконы в штативах для микроцентрифуги. Растопите корм для мушек и налейте по 2 mL в каждый флакон.

Дайте корму затвердеть, после чего накройте пробирки пластиковой пленкой. Начните с отбора самцов мух, которые содержались отдельно в меньших пробирках в изоляции. Случайным образом распределите их по двум группам.

Разделите особей на группы, которые подвергнутся вознаграждающему и невознаграждающему спариванию. Начиная с группы без вознаграждения, поместите в каждый флакон самку, которая ранее уже спаривалась. Затем, для группы с вознаграждением, поместите в каждый флакон девственную самку.

Наблюдайте за процессом спаривания, чтобы убедиться, что самцы, взаимодействующие с девственными самками, успешно спариваются в течение первого часа. Также убедитесь, что самцы, взаимодействующие с ранее спарившимися самками, не спариваются. Необходимо вести тщательное наблюдение, чтобы подтвердить, что когорта спарившихся особей действительно прошла через процесс спаривания, а когорта отвергнутых особей не смогла спариться.

Через один час удалите из эксперимента всех самцов из когорты отвергнутых, которым удалось спариться, а также самцов из когорты спарившихся, которые не вступили в спаривание к концу первого сеанса обучения. Завершите сеанс обусловливания, удалив путем аспирации ранее спарившихся самок из группы без вознаграждения; сохраните этих особей для последующих испытаний. В завершение удалите и утилизируйте самок из группы спарившихся самцов.

Дайте мухам отдохнуть в течение одного часа, затем повторите часовой тест на кондиционирование еще два раза с часовым перерывом между ними. Эти тренировочные сессии следует повторять ежедневно в течение последующих трех дней. После завершающего сеанса кондиционирования на четвертый день перенесите одиночных самцов с помощью аспиратора в капиллярные фидерные флаконы группами по шесть-восемь особей, объединяя мух из одной группы вознаграждения.

Используйте мягкую пробку, чтобы зафиксировать самцов во время переноса. После того как все мухи будут помещены внутрь, замените мягкую пробку пробкой капиллярной кормушки. Увлажните пробки, осторожно добавив по 5 mL воды на верхнюю часть каждой пробки, избегая попадания воды в виалу.

Приготовьте пищевые растворы этанола и воды, затем нанесите по пять микrolитровых капель каждого раствора на полоску лабораторной пленки. Дождитесь, пока раствор заполнит капилляр до отметки 5 µL. После этого аккуратно постучите по полоске, чтобы раствор расположился точно на предварительно отмеченной линии.

Герметизируйте концы капилляров, погрузив их в небольшие капли минерального масла. В завершение вставьте два капилляра — один с этанолом, другой без этанола — в адаптеры пробки. Открытые концы должны выступать над поверхностью пробки не более чем на один миллиметр.

Размещение отверстия капилляров близко к влажному тампону снижает испарение и обеспечивает легкий доступ к пище, так как мухи обычно сидят на тампонах и спускаются по открытому капилляру для кормления. Кроме того, подготовьте один контрольный флакон без мух, который будет использоваться для оценки естественного испарения. В завершение зафиксируйте относительное положение жидкости в каждом из капилляров во флаконах по отношению к черной линии в миллиметрах.

Поместите флаконы в экспериментальный инкубатор на 24 часа. Измерьте и запишите уровни жидкости в каждом извлеченном капилляре относительно черной линии. После начала эксперимента заменяйте капилляр ежедневно в установленное время.

Снова увлажните пробки двумя миллилитрами воды, а затем верните флаконы в инкубатор. Самцы плодовых мушек дикого типа штамма Canton S, собранные после вылета из куколки и выдержанные до четырехдневного возраста, оценивались в течение четырех дней на предмет их врожденного предпочтения к употреблению алкоголя. Анализ объемов, потребленных из растворов, содержащих этанол и не содержащих этанол, показывает, что мушки проявили значимое предпочтение к источнику пищи с 15% ethanol.

Эксперимент CAFE был повторен с использованием самцов, которые спаривались, и тех, кому в спаривании было отказано. Обе группы ранее содержались поодиночке и подвергались воздействию самок, которые либо приняли, либо отвергли спаривание. После группового помещения в виалы CAFE группа отвергнутых самцов потребляла больше из капилляров с этанолом.

Это позволило предположить, что воспринимаемое отсутствие вознаграждения приводило к усилению поведения, направленного на поиск вознаграждения. И наоборот, успешное спаривание повышает внутренний уровень вознаграждения, что, в свою очередь, снижает потребление этанола. При выполнении данной процедуры важно поддерживать высокую влажность среды на протяжении всего эксперимента, уделяя особое внимание этапу потребления: необходимо ежедневно смачивать ватные тампоны и располагать концы капилляров в непосредственной близости от влажных тампонов.