Одноместный измерительной ячейки из высвобождение дофамина с одновременным напряжения зажим и амперометрии

Целью данной процедуры является измерение обратного транспорта дофамина в нейроне с зафиксированным потенциалом мембраны (voltage clamp) с использованием одновременного патч-клампа и пирометрии для измерения высвобождения DAT-опосредованного дофамина. Это достигается путем предварительной проверки целостности пирометрического электрода с помощью дофамина. На втором этапе пирометрический электрод помещают рядом с клеткой и осуществляют запись от всей клетки (whole cell patch) нейрона с помощью патч-пипетки.

Затем с помощью патч-пипетки контролируют напряжение клетки и одновременно регистрируют высвобождаемый клеткой дофамин, опосредованный DAT, с помощью пирометрического электрода. Заключительным этапом является добавление блокатора DAT и повторная запись токов всей клетки и пирометрических токов, что позволяет вычесть ток, специфически опосредованный транспортером дофамина. Значимость данного метода заключается в возможности измерять обратный транспорт дофамина через транспортер дофамина при одновременном контроле напряжения дофаминергического нейрона.

Система одновременной регистрации методом локального прижима мембраны (patch clamp) и барометрии требует использования инвертированного микроскопа с высококачественной дифференциально-интерференционной оптикой (DIC) и объективом с большим рабочим расстоянием для создания источника постоянного света для системы. Для обеспечения низкого уровня электрического шума подключите источник освещения микроскопа к автомобильному аккумулятору. Гидравлические микроманипуляторы используются потому, что в данной конфигурации они практически не влияют на уровень шума.

Для фиксации потенциала (voltage clamp) и регистрации потенциалов всего This細胞 (whole-cell recording) используется правый манипулятор, а для пирометрии — левый. Для подготовки электрода для регистрации потенциалов всего клетки вытяните кварцевую пипетку с помощью вытяжки P 2000. Обычно мы используем пипетку с сопротивлением от трех до четырех МОм.

Затем с помощью пипетки заполните электрод раствором, содержащим 1 мM дофамина. После этого установите его в держатель для пипетки на правом манипуляторе. Обязательно оберните алюминиевой фольгой контейнер с раствором дофамина и храните его на льду, когда он не используется.

Поскольку дофамин подвержен окислению, хранение раствора на льду в защищенном от света месте позволит снизить скорость окисления. Вставьте серебряную проволоку в держатель электрода, затем накрутите параметрический адаптер на держатель электрода. Затем залейте в электрод достаточное количество ртути, чтобы она контактировала с серебряной проволокой.

После установки электрода в адаптер обязательно осмотрите малошумящее углеродное волокно pro CFE и параметрический электрод под микроскопом, чтобы убедиться в чистоте и целостности кончика. Держите углеродное волокно за дальний конец, чтобы защитить его кончик от повреждений. Затем установите электрод pro CFE Tric.

Затем закрепите собранный электрод на левом гидравлическом манипуляторе, чтобы проверить целостность электрода tric. Опустите его в чашку Петри с стеклянным дном, содержащую внешний раствор. Зарегистрируйте базовый ток в отсутствие дофамина.

Затем добавьте в чашку 10 µL раствора дофамина с концентрацией 1 mM. Исправный амперометрический электрод должен зафиксировать увеличение окислительного тока. Обязательно проверьте целостность амперометрического электрода до и после проведения экспериментов.

В данной процедуре из инкубатора извлекают чашку Петри с стеклянным дном, в которой находятся дофаминергические нейроны или клетки, модифицированные для экспрессии транспортера дофамина. Осторожно промойте клетки или дофаминергические нейроны трижды теплым внешним раствором. Для визуализации клеток и проведения эксперимента установите чашку Петри со стеклянным дном на предметный столик микроскопа и найдите точку фокусировки, обеспечивающую четкое изображение клеток.

Затем приложите положительное давление к патч-электроду. С помощью шприца объемом 1 мл осторожно опустите оба электрода в раствор и с помощью микроманипуляторов подведите их ближе к клетке. Затем расположите электрод для измерения тока на левой стороне клетки, а патч-электрод — на правой.

Когда патч-электрод касается клетки, создайте легкое разрежение с помощью рта или шприца для формирования гига-опечатывания (giga seal) с клеткой. После этого разрушьте опечатывание путем создания более сильного разрежения для перехода к конфигурации «целая клетка» (whole cell) и подождите от пяти до восьми минут для диализа внутреннего раствора, содержащего дофамин, в клетку.

Затем зарегистрируйте токи, опосредованные DAT, ступенчато изменяя напряжение клеточной мембраны от минус 60 до плюс 100 милливольт при удерживающем потенциале минус 40 милливольт через пипетку. Для определения специфического потока дофамина, опосредованного DAT, зарегистрируйте эмперические токи в отсутствие и в присутствии антагониста DAT. Специфический ток, опосредованный DAT, определяется путем вычитания кривых, записанных в присутствии антагониста DAT, из эмперических кривых, записанных без антагониста.

Отклонение тока в сторону увеличения соответствует выходящему потоку дофамина, показанному здесь. Токи, опосредованные DAT, были зарегистрированы путем ступенчатого изменения напряжения мембраны на 20 millivolts в диапазоне от минус 60 до плюс 100 millivolts при удерживающем потенциале минус four C millivolts с использованием пипетки, содержащей 2 millimolar дофамина, в режиме patch-clamp всего клетки. Здесь представлен амперометрический ток, зарегистрированный одновременно с током всего клетки.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как измерять обратный транспорт дофамина через дофаминовый транспортер в нейроне с зафиксированным потенциалом мембраны (voltage clamp). Не забудьте проверить целостность параметрического электрода до и после экспериментов, а также вычесть записи, полученные в присутствии антагониста, из записей, полученных без антагониста.