Оптическая запись запороговой нейронной активности с одноклеточных и одного всплеска резолюции
5 сентября 2012 г.
Понимание функции позвоночных центральная нервная система требует записи из многих нейронов корковых функций, потому что возникает на уровне популяций нейронов. Здесь мы опишем метод оптической записи запороговой нейронной активности с одноклеточных и одного всплеска разрешение, сглаживание случайного доступа сканирования. Этот метод записи соматических флуоресценции кальций сигналов от до 100 нейронов с высоким временным разрешением. Максимального правдоподобия алгоритм deconvolves основной запороговой нейронной активно
Общая цель эксперимента FollowMe заключается в регистрации нейронной спайковой активности большого количества нейронов. На первом этапе это достигается путем наблюдения с помощью флуоресцентной микроскопии за увеличением внутриклеточной концентрации кальция в соме нейрона, которое сопровождает каждый потенциал действия. Для регистрации флуоресцентных сигналов кальция от 40 сом нейронов с высоким пространственным и временным разрешением используются двухфотонное возбуждение и принцип сканирования с произвольным доступом.
На втором этапе точные моменты возникновения спайков извлекают из флуоресцентных сигналов с помощью алгоритма деконволюции. Этот метод позволяет регистрировать спайковую активность десятков нейронов. Полученные данные о спайках затем могут быть использованы для измерения взаимной информации, распространения сигнала между популяциями нейронов или нейронных корреляций.
Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как запись с помощью микроэлектродов, является возможность регистрировать спайковую активность большого количества нейронов из локальной популяции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о функциях коры на уровне локальных нейронных сетей, такие как значимость корреляций при поиске информации и изменения в динамике сетей при корковой пластичности. Для двухфотонного возбуждения используется инфракрасная импульсная лазерная система с фемтосекундными импульсами. Высокая выходная мощность лазера необходима для компенсации значительных потерь, вносимых оптическими компонентами системы.
Система из двух призм обеспечивает отрицательную дисперсию групповой скорости лазерных импульсов перед акустооптическими дефлекторами для компенсации временной дисперсии, вносимой AOD. Два AOD с большой апертурой отклоняют лазерный луч в двух измерениях. Отражательная дифракционная решетка с 100 штрихами на миллиметр установлена на расстоянии 13 сантиметров за AOD для компенсации пространственной дисперсии, вносимой AOD. При использовании коротких лазерных импульсов лазерный луч направляется с помощью двух ретрансляционных телескопов в порт камеры прямого микроскопа.
Диафрагмы устанавливаются с равными интервалами для юстировки оптических компонентов. Дихроичный светоделитель перед объективом пропускает инфракрасный возбуждающий свет к образцу и отражает флуоресцентный свет от образца на детектор. Эпи- и транс-флуоресцентные детекторы собирают сигнал флуоресценции через объектив; перед детекторами установлены цветные стеклянные фильтры конденсора, чтобы предотвратить попадание возбуждающего света на детекторы.
Углы отклонения A OD контролируются компьютером, оснащенным платой цифро-аналогового преобразователя, которая, в свою очередь, управляет генераторами, управляемыми по напряжению. Сигнал с фотоумножков проходит через фильтр Баттерворта нижних частот с частотой среза 100 кГц и оцифровывается аналого-цифровым преобразователем с тактовой частотой 156,25 кГц перед сохранением в компьютере для анализа. Юстировка и электрический шум проверяются путем записи распределения флуоресцентных сигналов с лазерным излучением и без него при низком и высоком усилении фотоумножков, а также с использованием и без использования индикатора. Дизеринговое сканирование с произвольным доступом основано на детектировании внутриклеточного повышения уровня кальция. Первым шагом протокола является окрашивание большого количества нейронов эфирной формой индикатора кальция путем болюсного введения.
Затем зарегистрируйте активность сомы каждого нейрона в четырех точках по 6,4 микросекунды в каждой точке. Чтобы выбрать интересующие нейроны, получите полный кадр размером 256 на 256 пикселей. Затем вручную отметьте на этом изображении центры нейронов, активность которых необходимо зарегистрировать.
В каждом цикле управляющее программное обеспечение автоматически добавляет три точки на расстоянии 2 мкм вокруг каждого центра. Флуоресцентный сигнал регистрируется в четырех точках для всех 40 нейронов. Регистрация сигналов от всех нейронов в одном цикле занимает 1,536 миллисекунды.
Повторите эту последовательную запись всех 40 нейронов в течение пяти секунд. Детекция спайков по флуоресцентным соматическим сигналам кальция зависит от высокого отношения сигнал/шум. Высокого отношения сигнал/шум можно добиться путем увеличения интенсивности возбуждения.
Однако интенсивность возбуждения можно увеличить лишь до определенного предела из-за фотоповреждения. Существует лишь очень узкий диапазон интенсивности возбуждения, при котором уровень фотоповреждения низок, а отношение сигнал/шум достаточно для обнаружения одиночных спайков, что позволяет гарантировать, что регистрируемые сигналы находятся в окне высокой чувствительности детектирования спайков. В ходе эксперимента используется ряд программ для анализа данных в режиме реального времени, разработанных в нашей лаборатории.
Далее рассчитайте приблизительную скорость потока фотонов на один нейрон, используя короткий временной интервал базового шума продолжительностью примерно от 100 до 200 мс. Количество фотонов и скорость их потока рассчитываются на основе значений флуоресценции путем аппроксимации распределения относительных изменений флуоресценции с помощью данного уравнения; затем рассчитайте базовую флуоресценцию для того же временного интервала и постройте её график в зависимости от времени или номера попытки. Регулируя мощность лазера, поддерживайте среднее снижение базовой флуоресценции на уровне ниже 0,0002 в секунду.
Поскольку эффективность обнаружения спайков резко снижается при превышении этого лимита. После этого каждые 10–20 минут проверяйте положение сомы нейронов, получая изображение полного кадра. При необходимости скорректируйте области регистрации.
Флуоресцентные сигналы, возникающие в результате нейронной активности, часто растянуты во времени из-за длительного затухания кальциевых транзиентов. В данной процедуре используется метод деконволюции для извлечения спайков и времени их возникновения из флуоресцентных сигналов. Здесь мы применяем генетический алгоритм для определения наиболее вероятной модели последовательности спайков, которая соответствует зарегистрированному флуоресцентному сигналу.
С каждой итерацией алгоритма функция максимального правдоподобия асимптотически приближается к своему максимуму, который определяется уровнем шума при регистрации флуоресценции. В неоднородных популяциях нейронов сигнал кальция, вызванный спайком, может варьироваться от нейрона к нейрону. Для проведения анализа больших наборов данных без учителя мы разработали алгоритм, который учитывает вариативность вызванного спайком кальциевого сигнала между нейронами, чтобы избежать большого количества ложноположительных результатов.
Совместное распределение амплитуды и постоянной времени затухания кальциевых транзиентов, вызванных одиночным спайком, регистрируется в отдельной серии экспериментов на нейронах того же типа при тех же экспериментальных условиях. Чтобы учесть медленные изменения базовой линии и снизить вычислительные затраты на деконволюцию, более длительные записи разделяются на несколько более коротких трейсов продолжительностью от одной до пяти секунд для каждого нейрона в каждой записи. Алгоритм деконволюции может тестировать большое количество моделей (до 1 миллиона различных моделей или более); для ускорения процесса деконволюция одного эксперимента может выполняться параллельно на 10 различных компьютерах.
После деконволюции данные о спайках анализируются и проверяются. Гистограмма вероятности спайков в периоде стимула и частота разрядов нейрона рассчитываются автоматически. Ниже приведены примеры флуоресцентного сигнала, записанного при очень низкой частоте возбуждения, и другого при очень высокой частоте возбуждения в окне детектирования.
Обратите внимание, что на каждом примере показан ответ на один спайк. Здесь представлена фотомикрофотография острого среза мозга и две стимулирующие пипетки, помещенные в один и тот же кортикальный столбец. В четвертом слое показаны нейронные ответы на повторяющиеся стимулы, а на этом графике представлена взаимная информация Шеннона, регистрируемая данной популяцией нейронов.
Ниже приведено измерение распространения надпороговой спайковой активности между различными популяциями корковых нейронов. Это зафиксированные спайки корковых нейронов в ответ на электрическую стимуляцию таламических корковых волокон. При записи нейронной активности с использованием сканирования с произвольным доступом крайне важно осуществлять запись в пределах окна детектирования.
В противном случае очень легко получить непригодные для использования наборы данных. Метод оптической регистрации спайков все еще находится на начальном этапе развития, и существует множество возможностей для его совершенствования.
Благодаря определенным усовершенствованиям мы регистрируем активность еще большего числа нейронов. Другие доработки позволят нам проводить запись даже у бодрствующих животных в процессе их поведения.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе представлен оптический метод регистрации спайковой активности нескольких нейронов с помощью флуоресцентной микроскопии. Данный метод обеспечивает высокое временное и пространственное разрешение при детектировании кальциевых сигналов, связанных с потенциалами действия.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Нейровизуализация
- Электрофизиология
Теоретические основы
- Понимание динамики нейронных популяций имеет решающее значение для нейробиологии.
- Кальциевые сигналы в нейронах коррелируют с потенциалами действия.
- Традиционные методы могут быть недостаточно эффективны для регистрации активности больших популяций нейронов.
- Флуоресцентная микроскопия обеспечивает неинвазивный способ мониторинга нейронной активности.
Цель исследования
- Разработать метод регистрации спайковой активности большого количества нейронов.
- Добиться высокого временного разрешения при детектировании нейронной активности.
- Обеспечить возможность анализа динамики нейронных популяций in vitro и in vivo.
Используемые методы
- Флуоресцентная микроскопия для наблюдения за внутриклеточной концентрацией кальция.
- Двухфотонное возбуждение для получения изображений высокого разрешения.
- Дизерированное сканирование с произвольным доступом для записи сигналов от нескольких нейронов.
- Алгоритм деконволюции для извлечения точного времени возникновения спайков из флуоресцентных сигналов.
Основные результаты
- Данный метод позволяет регистрировать кальциевые сигналы до 100 нейронов.
- Были достигнуты высокая эффективность детектирования и низкий уровень ложноположительных результатов.
- Данные о спайках могут быть использованы для измерения взаимной информации и распространения сигнала.
- Эта методика применима для изучения популяций нейронов в различных условиях.
Выводы
- Разработанный метод расширяет возможности изучения нейронной активности в больших популяциях.
- Он обеспечивает надежный способ детектирования спайков с высокой точностью.
- Данный подход может способствовать дальнейшим исследованиям нейронной динамики и взаимодействий.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Регистрация супрапороговой нейронной активности с разрешением до одной клетки и одного спайка позволяет снизить механистические риски при валидации мишеней за счет уточнения функциональной связности в кортикальных сетях. Данный подход повышает прогностическую достоверность доклинических моделей путем количественной оценки распространения сигнала и взаимной информации между популяциями нейронов. Масштабируемость метода до 100 нейронов позволяет применять его в рабочих процессах раннего поиска мишеней, требующих считывания данных на уровне популяции.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Проверка терапевтических гипотез путем картирования вызванных спайками кальциевых транзиентов в локальных нейронных сетях.
- Операционная ценность: Снижение биологических рисков за счет высокоточного детектирования надпороговой спайковой активности (эффективность >97%, <0,003 ложноположительных срабатываний/сек).
- Прогностическая ценность: Оптимизация портфеля исследований путем количественной оценки нейронных корреляций и информационного сигналинга в системах, релевантных для конкретного заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих рабочих процессов путем извлечения времени возникновения спайков с помощью деконволюции методом максимального правдоподобия.
- Операционная ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет высокой временной точности (~3 msec) и низкого дрейфа базовой линии (<0.0002/sec).
- Масштабируемость: Готовность к скринингу благодаря сканированию с произвольным доступом 40 нейронов за цикл с возможностью расширения до 100 нейронов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между фундаментальными открытиями и доклинической валидацией путем измерения распространения надпороговых спайков между популяциями нейронов коры головного мозга.
- Механистическое снижение рисков: позволяет принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении исследований с учетом рисков, связывая детектирование спайков с показателями взаимной информации и распространения сигнала.
- Релевантность для изучения заболеваний: применимо к моделям in vitro и моделям in vivo на анестезированных животных, что обеспечивает преемственность между различными экспериментальными системами.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод интегрируется в континуум научных открытий — от проверки гипотез до идентификации перспективных соединений-лидеров — обеспечивая считывание нейронной активности на популяционном уровне, что способствует механистическому пониманию процессов.
- Открывающая биология: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей за счет регистрации спайковой активности десятков нейронов в локальных сетях.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа благодаря количественным флуоресцентным сигналам, извлеченным из переходных процессов кальция с высоким отношением сигнал/шум.
- Аналитика: Позволяет сравнивать условия с помощью автоматизированных пеristимульных временных гистограмм, расчета вероятности спайка и частоты разрядов.
- Трансляционные исследования: Обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями путем измерения распространения сигнала между популяциями нейронов, что является ключевым биомаркером функции сети.
- Корпоративное повторное использование: Служит многократно используемым инструментом для лонгитюдных исследований динамики сетей при фармакологическом или генетическом воздействии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в динамике нейронных популяций.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизацию и масштабируемость благодаря компьютерному управлению сканированием AOD и параллельной деконволюции в нескольких системах.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки за счет возможности количественной оценки нейронных корреляций и информационных потоков.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков благодаря воспроизводимым данным о спайковой активности высокого разрешения в локальных корковых сетях.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с двухфотонной микроскопией, кальциевым имиджингом и оптимизацией алгоритмов деконволюции.
- Работа зависит от наличия инфракрасных импульсных лазерных систем, акустооптических дефлекторов и инфраструктуры высокоскоростного аналого-цифрового преобразования.
- Необходима межгрупповая стандартизация мониторинга базовой флуоресценции и поддержания соотношения сигнал/шум в режиме реального времени.
- Требуется адаптация методик при переходе от срезов in vitro к препаратам in vivo на анестезированных животных.
- Ограничения накладываются порогами фотоповреждения, которые ограничивают интенсивность возбуждения и, следовательно, чувствительность детектирования спайков.
