Мониторинг восстановительной и окислительной Half-Реакции Флавин-зависимой монооксигеназной использованием Остановлено-Flow спектрофотометрии

В данной процедуре используется прибор для остановленного потока (stopped flow) для обнаружения различных спектральных форм SID A и измерения скоростей реакций. Реакция, катализируемая SID A, может быть разделена на восстановительную и окислительную полуреакции FAD. Окисленный флавин связывается с N-A-D-P-H и вступает в реакцию с образованием восстановленного флавина и NADP, после чего реакция с молекулярным кислородом и связывание орнитина приводят к образованию C four.

После гидроксилирования орнитина образуется гидроксифлавин, который затем подвергается дегидратации с образованием окисленной формы фермента. NADP+ остается связанным на протяжении всего каталитического цикла и является последним высвобождаемым субстратом. Прибор со встроенным устройством остановленного потока обеспечивает быстрое смешивание малых объемов реагентов и регистрацию данных.

Спектрофотометр позволяет измерять скорость образования и распада transient intermediates в ферментативной реакции, отслеживая спектральные изменения во времени. Два сотрудника моей лаборатории, Рита Робинсон и Энвиро Ромеро, продемонстрируют эти эксперименты, используя в качестве модельной системы флавин-монооксигеназу из набора A. Налейте 250 milliliters 100 millimolar калий-фосфатного буфера в колбу Бухнера объемом 500 milliliters, содержащую магнитный перемешиватель.

Загерметизируйте колбу резиновой пробкой, затем поместите её на магнитную мешалку и подсоедините короткий отвод колбы к линии Шленка. Удалите растворенный газ из буфера под вакуумом в течение одного часа при комнатной температуре с перемешиванием, после чего продуйте систему аргоном. Повторите процедуру пять раз.

В завершение продуйте колбу аргоном в течение 10 секунд. Отсоедините колбу от вакуумного коллектора и поместите ее в перчаточный бокс. Продолжайте интенсивно перемешивать содержимое при открытой колбе.

Заполните шприцы-резервуары растворами глюкозооксидазы в концентрации 18,13 ед/мл и глюкозы 100 мМ. Затем установите приводные клапаны в положение загрузки. Заполните приводные шприцы.

Затем переведите клапан F в рабочее положение. С помощью программного обеспечения для управления данными pro data нажмите «очистить стоп-шприц» (empty the stop syringe), затем вытесните буфер из рабочего шприца F через контур потока, вручную поднимая соответствующий толкатель шприца. Повторите процедуру с тремя другими рабочими шприцами; время уравновешивания составляет один час.

Теперь снова наполните шприцы-резервуары и повторите промывку системы с остановленным потоком. Для подготовки насыщенного кислородом буфера продуйте раствор 100% кислородом в течение одного часа при перемешивании.

Затем извлеките короткую иглу из флакона и подождите 10 секунд. После этого извлеките длинную иглу и поместите закрытый флакон в перчаточный бокс. Для раствора N-A-D-P-H.

Поместите в перчаточный бокс микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл, содержащую 1 мг NADPH. Растворите вещество в 300 µL анаэробного 100 мМ калий-фосфатного буфера с pH 7.5.

Отберите 30 µL для определения концентрации N-A-D-P-H. Теперь, чтобы удалить кислород из запаса фермента, перенесите раствор в флакон объемом 25 мл с магнитной мешалкой, закрыв его пробкой и алюминиевым уплотнителем. Поместите на лед.

Подключите флакон к линии Шленка, затем удалите воздух с помощью вакуума в течение 20 минут, после чего промойте систему аргоном. Наконец, продуйте флакон аргоном в течение 10 секунд и отсоедините его от вакуумного коллектора. Поместите флакон на лед внутри перчаточного бокса.

В окне панели управления программного обеспечения pro data выберите фотодиодная матрица, внешний триггер и логарифмическая шкала. Также запустите программное обеспечение pro data viewer и укажите каталог для хранения файлов данных.

Теперь замените раствор в резервуарных шприцах C и F на анаэробный 100 мМ калий-фосфатный буфер с pH 7.5. Переведите клапаны C и F в рабочее положение (drive). В программном обеспечении управления данными (pro data control software) нажмите «очистить стоп-шприц» (empty the stop syringe).

Затем вытолкните буфер из обоих приводных шприцев через контур потока, вручную поднимая соответствующий приводной толкатель. Повторите промывку шприцами резервуаров C и F еще три раза. Чтобы обеспечить полное удаление глюкозооксидазы из контура потока, нажмите baseline в программном обеспечении Pro Data Control.

Замените раствор в резервуарном шприце F раствором фермента. Поверните клапан F в положение подачи. В программном обеспечении Pro Data Control нажмите «опорожнить стоп-шприц» (empty the stop syringe).

Выдавите раствор фермента из шприца-дозатора F через контур потока, вручную поднимая соответствующий приводной шток. Вернитесь к программному обеспечению управления данными Pro для установки времени сбора данных на 60 секунд. Убедитесь, что оба шприца-дозатора заполнены соответствующими растворами и что приводные штоки контактируют с поршнями шприцов-дозаторов.

Переведите оба клапана в положение «drive» и нажмите «acquire» в программном обеспечении Pro Data Control для выполнения подачи. Снимите спектральные данные окисленной формы фермента в трех повторах, используя значение A 452 нм, полученное при подаче. Определите концентрацию фермента перед смешиванием и приготовьте 4 мл раствора N-A-D-P-H.

Заполните шприц резервуара C раствором N-A-D-P-H, который в 1,5 раза более концентрирован; трижды опорожните и снова заполните стопорный шприц, как было показано ранее. Теперь зарегистрируйте спектры во время восстановления фермента, промывая содержимое проточной системы анаэробным 100 мМ калий-фосфатным буфером с pH 7,5. После этого нажмите кнопку baseline в программном обеспечении Pro Data Control.

Затем смешайте 200 µL основного раствора фермента с 1000 µL анаэробного 100 мМ калий-фосфатного буфера с pH 7,5. Замените раствор в резервуарном шприце A раствором фермента.

В программном обеспечении для управления данными переведите клапан A в положение подачи (drive). Нажмите кнопку «остановить при опорожнении шприца» (stop syringe empty). Протолкните раствор фермента из приводного шприца A через контур потока, вручную поднимая соответствующий приводной поршень.

Установите время задержки на 0,5 seconds и время сбора данных на 60 seconds. Убедитесь, что все шприцы дозатора заполнены соответствующими растворами, а поршни дозатора соприкасаются с поршнями шприцев. Затем переведите все клапаны дозатора в рабочее положение и нажмите кнопку acquire в программном обеспечении pro data control.

Получите спектральные данные окисленной формы фермента в трех повторностях. Затем замените раствор в резервуарном шприце B раствором N-A-D-P-H, концентрация которого в 1,5 раза выше, чем концентрация раствора фермента в шприце A. Переведите клапан B в рабочее положение, а затем трижды опорожните и снова заполните стоп-шприц, как было показано ранее в окне панели управления.

Установите время задержки на 0.5 секунд. При достижении 20 секунд сбора данных замените раствор в резервуарном шприце на оксигенированный буфер. Переведите клапан C в рабочее положение.

Выполните промывку три раза в программном обеспечении pro data control. Установите время задержки на 15 секунд, а время сбора данных — на 900 секунд. Продолжайте регистрировать спектры в процессе повторного окисления полностью восстановленного фермента в приборе с остановленным потоком.

Анаэробное восстановление SID A с помощью N-A-D-P-H можно контролировать, измеряя изменения окислительно-восстановительного состояния флавина с помощью абсорбции при 452 нм. Спектральные изменения регистрируются с течением времени от окисленного SID A до последнего спектра полностью восстановленного SID A. Скорость этой ферментативной стадии может быть определена путем аппроксимации данных соответствующим уравнением. Скорость окисления и промежуточные продукты реакции также могут быть определены с использованием режима двойного смешивания установки stopped-flow в этой реакции с AF Sid A. Промежуточное соединение C four A Hydroxi flavin четко детектируется с lambda max 380 нм, а окисленный фермент имеет lambda max 450 нм.

При должном навыке выполнение данной методики при правильном подходе занимает от четырех до шести часов. Не забудьте убедиться, что растворы являются анаэробными. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как исследовать как относительную, так и язвенную ионы FLA независимо от дальнейших экспериментов, таких как экспресс-химический анализ.

Метод Квентина может помочь прояснить истинную природу интермедиатов.