Преобразование Capture ИФА в Пробирной Luminex Xmap помощью скрининга Мультиплекс антител методом

Общая цель следующего эксперимента заключается в переносе предварительно оптимизированного анализа ELISA для цитокина TNF Alpha на платформу Xap с одновременной оценкой альтернативных пар антител. Это достигается путем связывания захватывающего антитела из набора ELISA, а также трех других потенциальных захватывающих антител с четырьмя различными наборами микросфер или бусин при их смешивании. Эти четыре набора позволяют одновременно протестировать всех четырех кандидатов с помощью четырех отдельных детектирующих антител для определения наилучшей пары антител.

Следующие два анализа Xap проводятся с использованием двух наиболее оптимальных пар антител. Затем эффективность этих анализов сравнивается с оригинальным методом EISA с точки зрения интенсивности сигнала, динамического диапазона и чувствительности. Результаты показывают, что схожие антитела могут вести себя совершенно по-разному при одинаковых условиях и что несколько антител можно скринировать одновременно с помощью анализа Luminex Xap, что свидетельствует о повышенной чувствительности и более широком динамическом диапазоне данного метода по сравнению с EISA.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими, такими как EIS A, является то, что иммуноанализы на основе xap позволяют исследователю тестировать несколько мишеней или, как в данном случае, одновременно тестировать несколько антител для выявления наилучшего из представленных. Процедуру продемонстрирует Эрика Лопес, научный сотрудник корпорации Luminex.

Начните выполнение данного протокола с отбора и подготовки четырех захватывающих антител и четырех детектирующих антител, специфичных к человеческому TNF alpha, как описано в письменном протоколе. Также подготовьте одно подтверждающее антитело, специфичное к виду организма-хозяина захватывающих антител. Доведите реагенты из набора для связывания антител до комнатной температуры.

Маркируйте четыре реакционные пробирки номерами регионов микросфер, выбранных для реакции конъюгации. Перенесите содержимое четырех флаконов с микросферами MagPlex в четыре маркированные реакционные пробирки. Дважды промойте каждый набор микросфер в 500 µL активационного буфера и активируйте каждый набор микросфер растворами сульф-ONHS и EDC, как описано в наборе для конъюгации антител.

Руководство пользователя: после 20-минутной инкубации на ротаторе повторите предыдущий этап промывки с уже активированными гранулами в общей сложности три раза, используя 500 µL буфера для активации. Для каждой промывки приготовьте четыре отдельных раствора по 500 µL, каждый из которых содержит 7,5 µg антитела для захвата в буфере для инактивации.

Добавьте эти четыре раствора захватывающих антител в соответствующие реакционные пробирки. Сразу же перемешайте каждую пробирку на вортексе и инкубируйте в течение двух часов на ротаторе. Повторите стадию промывки уже конъюгированных бусин в общей сложности три раза, используя по 500 µL промывочного буфера, входящего в комплект для конъюгации антител.

После заключительного этапа промывки добавьте в каждую реакционную пробирку 500 µL промывочного буфера, чтобы получить конечную концентрацию стока 5 миллионов бусин с конъюгированными антителами на mL, перемешайте на вортексе, а затем обработайте пробирки ультразвуком для диспергирования бусин. Подсчитайте количество бусин, полученных после реакции конъюгации, с помощью счетчика клеток или гемоцитометра. Выход после реакции конъюгации обычно составляет более 90%. Подтвердите успешное проведение реакции конъюгации, приготовив для каждого набора тестовые растворы стоков конъюгированных бусин с конечной концентрацией 100 бусин на µL в аналитическом буфере, а также приготовьте разведения FICO erything labeled antis species.

Добавьте подтверждающие антитела IgG в концентрации 4 µg/mL в буфере для анализа, перенося по 50 µL каждого тестового раствора в четыре лунки круглодонного 96-луночного планшета, всего в 16 лунок. Затем добавьте по 50 µL буфера для анализа в восемь лунок для измерения фонового сигнала и по 50 µL разведенных подтверждающих антител в восемь оставшихся лунок. Осторожно перемешайте реакционные смеси, несколько раз прокачав содержимое вверх-вниз с помощью многоканального дозатора.

Накройте планшет и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре на шейкере для планшетов. Поместите планшет на магнитный сепаратор для планшетов на одну-две минуты, чтобы осадить частицы из раствора. Затем удалите жидкость, резко перевернув планшет над емкостью для отходов, не снимая его с сепаратора.

Промойте каждую лунку дважды, добавив 100 µL assay buffer и удалив SANE с планшета аналогичным способом. С помощью магнитного сепаратора для планшетов ресуспендируйте гранулы в 100 µL assay buffer, осторожно пропипетируя содержимое вверх-вниз пять раз с помощью многоканального дозатора. Проведите анализ на приборе Luminex xMAP, например, на приборе Magix.

Интенсивность флуоресцентного сигнала этой реакции прямо пропорциональна количеству белка на поверхности микросфер, что позволяет быстро оценить относительное количество белка, иммобилизованного на микросферах. Чтобы определить наиболее эффективную пару антител для анализа xap, приготовьте исходную смесь из всех четырех наборов микросфер, добавив по 10 µL каждого из них в 0,96 mL буфера для анализа. Приготовьте растворы детектирующих антител, разводя каждое антитело в буфере для анализа до концентрации 1 µg/mL.

Также используется буфер для анализа. Приготовьте стандарт белка TNF alpha от R&D Systems в концентрации 2000 pg/mL и разведите стрептавидин R-FICOeryn до концентрации 8 µg/mL. Добавьте по 50 µL смеси бусин, конъюгированных с антителами, в каждую из 16 лунок 96-луночного планшета CoStar с круглым дном для проведения скринингового анализа.

Затем добавьте по 50 µL assay buffer в восемь из 16 лунок для измерения фонового сигнала. Далее внесите по 50 µL стандарта TNF alpha в остальные восемь лунок для измерения отклика. Инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре в защищенном от света месте на шейкере для планшетов.

Затем добавьте по 50 µL каждого из четырех детектирующих антител в четыре лунки, две из которых являются контрольными (фоновыми), а две — опытными. Инкубируйте в течение 30 минут при тех же условиях, после чего добавьте по 50 µL реагента SAPE во все лунки. Повторно инкубируйте в течение 15 минут при тех же условиях.

Поместите планшет на магнитный сепаратор на одну минуту. Затем удалите жидкость, резко перевернув планшет вместе с сепаратором над контейнером для отходов. Пипетируйте по 100 µL буфера для анализа в каждую из 16 лунок.

Затем удалите жидкость с гранул с помощью магнитной сепарации. Далее добавьте по 100 µL assay buffer в каждую из 16 лунок. Считайте планшет на приборе Luminex mag picks, следуя инструкциям из руководства пользователя по правильной эксплуатации.

Выберите пару антител, обеспечивающую требуемую интенсивность сигнала. После выбора оптимального захватывающего антитела разведите 100 µl стокового раствора антител, конъюгированных с бисерами, до 10 mL с помощью буфера для анализа. Добавьте по 50 µL разведенных бисеров в 78 лунок двух 96-луночных планшетов CoStar с круглым дном.

Каждый планшет будет использоваться для оценки эффективности различных детектирующих антител. Затем подготовьте стандартную кривую из 12 точек, начиная с 8 000 pg/mL и заканчивая 4 pg/mL. С использованием систем R&D Systems.

Добавьте стандарт TNF Alpha: по шесть повторностей каждого разведения объемом 50 µL в каждую лунку планшета, а также 50 µL assay buffer в шесть лунок для определения фона, что в общей сложности составит 78 лунок на планшет. Инкубируйте планшеты в течение одного часа при комнатной температуре в защищенном от света месте на шейкере для планшетов. Затем добавьте 50 µL первой детектирующей антитело во все 78 лунок первого планшета.

Повторите процедуру для второго детектирующего антитела на втором планшете. Инкубируйте планшеты в течение 30 минут при тех же условиях. Затем добавьте по 50 µL реагента SAPE во все лунки каждого планшета.

После встряхивания двух планшетов в течение 15 минут в защищенном от света месте поместите планшеты на магнитные сепараторы для планшетов на одну минуту. Удалите жидкость, резко перевернув планшет над емкостью для отходов, пока он находится на сепараторе. Затем внесите по 100 µL assay buffer в каждую из 78 лунок планшетов перед тем, как удалить жидкость с магнитных бусин, как было описано ранее.

После добавления 100 µL assay buffer к микросферам в каждой из 78 лунок планшетов, проанализируйте планшеты на приборе MagPicks, руководствуясь руководством пользователя для обеспечения правильной работы. Следуйте инструкциям, входящим в комплект набора human TNF Alpha TNF SF1a DUOset ELISA от R&D Systems. Измерьте отклик, полученный с использованием стандарта, прилагаемого к набору R&D.

Повторите анализ ELI a еще три раза, заменив захватывающие и детектирующие антитела R&D Systems антителами других производителей. Для упрощения объедините антитела по производителям и независимо оцените каждую пару в соответствии с форматом EISA с каждым из трех стандартов белка TNF Alpha. Анализы Luminex Xap проводились в режиме мультиплексирования для оценки всех четырех захватывающих антител в виде смеси путем объединения четырех наборов антител к TNF alpha, конъюгированных с микросферами Mag PLX; захватывающие антитела оценивали с каждым из четырех биотинилированных детектирующих антител по отдельности, чтобы можно было одновременно определить взаимодействие одного детектирующего антитела с каждым из четырех захватывающих антител.

Результаты показали, что пара антител из набора DUO компании R&D Systems продемонстрировала наилучшие показатели с результирующим откликом 6 183 единиц медианной интенсивности флуоресценции (MFI). Также было отмечено, что детектирующие антитела от Millipore и ABAM обеспечивали приемлемый отклик в анализе XAP при использовании в сочетании с захватывающим антителом от RD Systems, в то время как захватывающие антитела от Millipore, ACAM и Novus давали менее удовлетворительный отклик в анализе XAP. Для сравнения четырех пар антител в формате EISA использовался протокол набора DUO от R&D Systems.

Протокол компании R&D Systems использовался для всех пар антител, так как он отражает типичные протоколы EIA, широко применяемые сегодня, и аналогичен протоколам, используемым в технологии XAP. Тесты EISA показали, что пара антител от R&D Systems снова дала наилучшие результаты. Пара антител от Acam не дала ответа, а пары антител от Millipore и Novas показали умеренный ответ; данные сравнения были проведены для оценки любой вариабельности реактивности антител.

С использованием стандарта все четыре пары антител были протестированы с тремя различными стандартами рекомбинантного белка TNF alpha от трех разных поставщиков. Данные показывают, что стандарты рекомбинантного белка TNF alpha от трех поставщиков дали эквивалентные результаты. Белок TNF alpha от r and d systems использовался для построения стандартных кривых в анализах ELSA и XAP.

В то время как анализ ELI A проводили с использованием пары антител от R&D Systems, в анализах Xap использовали захватывающее антитело от R&D Systems и либо детектирующее антитело от R&D Systems, либо от Millipore. Белок TNF alpha от R&D Systems разводили для получения диапазона концентраций от 8 000 до 4 pg/mL. Пара антител от R&D Systems в анализе Xap дала ожидаемый результат с откликом более 20 000 MFI, как показано на графике.

При использовании детектирующего антитела от Millipore в анализе Xap вместо детектирующего антитела от R&D Systems ответ составил около 30% от ответа, полученного с использованием детектирующего антитела от R&D Systems. Зеленая линия на данном графике представляет собой стандартную кривую ИФА, для которой рекомендуемый производителем диапазон TNF alpha составлял от 16 до 1000 pg/mL. Из-за ограничений спектрофотометра увеличить диапазон анализа ИФА было невозможно.

Более того, динамический диапазон и чувствительность обоих методов лучше иллюстрируются при построении графика в логарифмическом масштабе. Заметное различие между наклоном кривой отклика EISA и откликами в анализах xap указывает на более ограниченную способность ELISA обнаруживать TNF alpha как при более высоких, так и при более низких концентрациях. Пределы обнаружения или LOD для двух функциональных анализов xap на TNF alpha были приближенно определены путем выявления минимальной концентрации TNF alpha, при которой наблюдаемый уровень отклика превышал уровень фона плюс три стандартных отклонения (SD), рассчитанных по шести повторностям.

Здесь можно заметить, что при использовании пары антител от R&D Systems самая низкая концентрация TNF alpha, составляющая 3,91 picograms per milliliter, вызвала ответ в 66 MFI, что превышает значение фона плюс три SD, соответствуя данному критерию. При использовании детектирующего антитела от Millipore с захватывающим антителом от R&D Systems предел обнаружения составил менее 7,81 picograms per milliliter.

В данном случае вторая по минимальности концентрация TNF alpha вызвала приемлемый ответ в 17 MFI, что превышает ответ при самой низкой концентрации TNF alpha плюс три стандартных отклонения. Аналогично, предел обнаружения для набора r and d systems duo set Eliza был оценен в диапазоне от 63 до 31 пикограмма на миллилитр. После выполнения этой процедуры могут быть проведены другие этапы, такие как тестирование различных матриц образцов или концентраций антител в репортере, с целью дальнейшей оптимизации анализа xap.