Шаг за шагом метод для разведения Transporter ABC в Nanodisc липидных частиц

Общая цель данной процедуры заключается во включении ABC-транспортера, в данном случае транспортера мальтозы malf GK 2, в растворимые мембранные нанодиски. Это достигается путем предварительного смешивания мембранного каркасного белка MSP с транспортером и соответствующим количеством липидов в детергентных мицеллах.

На втором этапе добавляют полистирольные гранулы и осторожно перемешивают смесь в течение ночи; детергент постепенно абсорбируется гранулами, что способствует формированию частиц нанодисков. Затем гранулы удаляют путем седиментации. Заключительным этапом является отделение правильно сформированных дисков от агрегатов и несобранных белков-каркасов с помощью гель-фильтрационной хроматографии.

Наконец, качество дисков оценивают с помощью электрофореза в нативном геле или спектроскопии динамического рассеяния света. Основным преимуществом данного метода по сравнению с другими, такими как использование липосом, является то, что мембранные белки и диски полностью растворимы в водном растворе. Кроме того, теперь белковые домены доступны с обеих сторон.

Поскольку теперь мембранный компартмент отсутствует, использование мембранных каркасных белков различной длины позволило мне захватывать и изучать различные состояния связок мембранных белков. Что наиболее важно, этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области протеомики мембран, такие как идентификация новых партнеров по связыванию ABC-транспортеров. Фактически, возможности данной методики распространяются и на терапию, так как она может способствовать поиску активаторов или ингибиторов мембранных белков и рецепторов.

Хотя этот метод кажется простым, при выборе правильного соотношения белков и липидов следует соблюдать осторожность. Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, сталкиваются с трудностями при расчете правильного молярного соотношения или при проведении надлежащего контроля, гарантирующего качество препарата. Поэтому визуальная демонстрация этого метода очень полезна для студентов, изучающих последовательность действий и возможные сложности.

Для начала экспрессии MSP с гексагистидиновой меткой в штамме e coli BL21(DE3) из плазмиды pMSSP1D1 индуцируют синтез белка при достижении оптической плотности при 600 нм около 0,5; инкубацию проводят в течение трех часов при 37 °C. Сбор клеток осуществляют центрифугированием при 5 000 ×g в течение 10 минут при 4 °C. Осадок ресуспендируют в буфере TSG 10, содержащем 100 µM PMSF. Клетки подвергают лизису в французском прессе трижды при давлении 8 000 PSI. Нерастворимый материал удаляют центрифугированием при 5 000 ×g в течение 10 минут при 4 °C. Затем растворимую фракцию, содержащую MSP, выделяют путем ультрацентрифугирования при 125 000 ×g в течение 45 минут.

Очистите MSP методом никель-хелатной хроматографии, используя приблизительно 1.5 milliliters никель-сероза высокой эффективности в буфере TSG 10. Отмойте примеси буфером TSG 10, содержащим 50 millimolar имидазола. Элюируйте MSP буфером TSG 10, содержащим 600 millimolar имидазола, после диализа.

Очищенный белок в буфере TSG 10 MSP можно хранить при температуре минус 70 градусов Цельсия и концентрации белка примерно от 10 до 15 мг/мл. Комплекс MALF GK два с His-тегом на C-конце MAL K экспрессируют из плазмиды PED 22 FG K в штамме e coli BL 21 DE три; продукцию белка индуцируют при достижении оптической плотности при 600 нм около 0,5 с помощью 0,2% L-арабинозы в течение трех часов при 37 градусах Цельсия с последующим лизисом клеток и центрифугированием.

Как и прежде, мы суспендируем мембранный осадок в буфере TSG 20 до конечной концентрации 5 mg/mL. Затем материал сольватизируют 1% (w/v) GDM в течение трех часов при 4 °C при осторожном встряхивании. Нерастворимый материал удаляют путем ультрацентрифугирования, как это было описано при очистке MAL FTK two.

Затем соберите супернатант, содержащий солюбилизированный комплекс mal FTK two, и повторно очистите его с помощью никель-хелатной хроматографии. Дополнительно очистите комплекс методом гель-фильтрационной хроматографии в буфере TSGD на колонке SUEx 200, HR ten three hundred при скорости потока 0.5 milliliters per minute. Для подготовки фосфолипидов общий экстракт липидов e coli, растворенный в хлороформе, разделяют на 1000 anomal аликвот в микроцентрифужные пробирки с винтовыми крышками, выпаривают растворитель под слабым током азота и досушивают в вакууме в течение ночи.

Затем высушите образец, растворите липидную пленку в буфере TS с конечной концентрацией NMO пять м.о. и интенсивно перемешайте на вортексе, после чего проведите импульсный ультразвуковой облучение пять раз примерно по пять секунд. Растворенные липиды будут выглядеть слегка опалесцирующими из-за их общей нерастворимости в водном буфере TS, но они должны оставаться в суспензии. Добавьте DDM до конечной концентрации 0,5%. В этот момент раствор станет прозрачным; поместите смесь липидов в водяную баню и проведите импульсный ультразвуковой облучение пять раз примерно по пять секунд.

Липидную смесь можно хранить при температуре 4 °C не более одной недели. Для подготовки биосфер (bio-beads) поместите примерно 10–15 мл биосфер в пробирку объемом 50 мл. Сначала промойте сферы 50 мл 100% метанола.

Дайте гранулам осесть под действием силы тяжести, затем осторожно слейте раствор. Повторите эту процедуру один раз для метанола, затем дважды для 95% Ethanol, воды milli Q и, наконец, для буфера TS. Приступите к нанодискретному составлению, разбавляя MSP в буфере TSGD до конечной концентрации примерно 7 mg/mL или 0,3 mM.

Для обеспечения успешного проведения эксперимента важно правильно подобрать соотношение смешиваемых липидов и белков. Смешайте примерно 2 мкМ очищенного комплекса malf GK two в буфере TSGD при соотношении белок:MSP:липид 1:3:60 до конечного объема 300 µL; также в качестве отрицательного контроля готовится образец с избытком липидов в соотношении 1:3:400. Добавьте в пробирку 50 µL суспензии биосфер (bio-beads) и инкубируйте смесь в течение ночи на встряхивателе при температуре 4 °C. На следующий день осадите биосферы под действием силы тяжести. После того как биосферы осядут, перенесите раствор с помощью узкого наконечника, стараясь максимально избежать захвата биосфер.

Удалите крупные преципитаты путем ультрацентрифугирования при 100, 000 GS в течение 20 минут. Затем приступайте к очистке дисков методом гель-фильтрационной хроматографии, как было описано ранее, используя буфер TSG 10. После этого введите Eloqua в ту же колонку для гель-фильтрации, чтобы проверить стабильность препарата.

Затем объедините фракции, содержащие нанодиски. Качество препарата оценивают с помощью электрофореза в нативном геле. Проанализируйте 1 µM нанодисков для оценки качества реконституции.

Также оцените связывание mal E с комплексом mal ftk two, реконструированным в нанодисках. После электрофореза окрасьте гель кумасси синим в течение 10 минут и промывайте его в течение примерно одного часа. Для проведения динамического рассеяния света (DLS) сначала очистите нанодиски методом гель-фильтрационной хроматографии, как описано ранее, используя колонку SUEx 200 HR ten three hundred при скорости потока 0.1 мл/мин.

Объедините фракции, содержащие нанодиски, и сконцентрируйте их примерно до 10 mg/mL с помощью центрифужного фильтра AmCon. Затем дважды отфильтруйте образец. Проведите анализ методом DLS с использованием прибора dynapro nano star в кварцевой кювете с внутренним объемом 1 µL.

Используя программное обеспечение для динамического рассеяния света для оценки диаметра и молекулярной массы частиц, определите АТФазную активность двух реконструированных нанодисков mal FTK с помощью колориметрического анализа. Сначала смешайте 1 µM очищенных дисков и 1 mM АТФ с возрастающим количеством mal e. Инкубируйте образцы при 37 °C в течение 20 минут.

Затем измерьте высвобождение неорганического фосфата при 660 нанометрах. Сравните количество высвобожденного фосфата со стандартной кривой, построенной с помощью стандартного раствора фосфора. Нанодиски очищают методом гель-фильтрационной хроматографии.

На хроматограмме видно, что большинство реконструированных дисков элюируются в виде одного пика, в то время как диски, полученные с избытком липидов, элюируются в мертвом объеме и в виде серии широких пиков; качество приготовления дисков дополнительно анализируют с помощью нативного гель-электрофореза: диски, реконструированные с ограниченным количеством липидов, мигрируют в виде четкой полосы на нативном геле, тогда как реконструированные в присутствии избытка липидов мигрируют в виде размытых зон. Анализ методом DLS показывает, что популяция дисков однородна, со средним радиусом 5.0 nanometers. Согласно данным DLS, реконструированные диски имеют кажущуюся молекулярную массу 215 kilodaltons; образцы, реконструированные в присутствии избытка липидов, демонстрируют широкий разброс радиусов около 100 nanometers, что характерно для неоднородных образцов.

Активность комплекса MAL FTK 2 оценивают путем измерения скорости гидролиза ТФ и сродства к взаимодействующим партнерам, таким как мальтозосвязывающий белок MAL E. С помощью неденатрирующего гель-электрофореза установлено, что MAL E связывается с транспортером MAL FTK 2 с высоким сродством. Таким образом можно обнаружить комплекс между MAL E и MAL FTK 2; здесь показана стимуляция активности MAL KA TPA белком MAL E в зависимости от концентрации MAL E.

Создание нанодисков относительно просто, однако даже небольшие отклонения от оптимальных условий могут привести к необратимой агрегации белков; после освоения этой методики процедура занимает менее двух дней. При выполнении данного протокола важно помнить о необходимости выбора правильного соотношения белка и липидов, так как избыток липидов приведет к образованию крупных полидисперсных липосомоподобных частиц. Крайне важно тщательно анализировать качество реконструированного материала, используя методы, помимо гель-фильтрации, такие как спектроскопия светорассеяния, аналитическое ультрацентрифугирование или, что проще, электрофорез в нативных условиях.

Помните, что тип фосфолипида, входящего в состав диска, а также тип белка-каркаса мембраны могут влиять на эффективность реконституции. Мы надеемся, что после просмотра этого видео вы получили четкое представление о том, как создавать растворимые и гомогенные нанодиски, содержащие выбранный вами мембранный белок. Желаем удачи в ваших экспериментах.