Высокая пропускная способность синтеза углеводов и Функционализация Polyanhydride наночастиц

В данной видеостатье мы описываем новый протокол для автоматизированного синтеза олигосахаридов в гомогенной фазе и функционализации полиангидридных наночастиц. Для создания этих углеводных таргетных агентов сначала синтезируются молекулы углеводов с использованием автоматизированной системы, в которой применяется синтез в гомогенной фазе вместо твердофазных синтезаторов. Затем промежуточные олигосахариды очищают с помощью твердофазной экстракции (FSPE).

Полученные молекулы углеводов характеризуют с помощью ЯМР, после чего их присоединяют к полиангидридным наночастицам посредством карбоидного конъюгирования. В завершение функционализированные углеводами наночастицы характеризуют с помощью рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии и анализа с использованием гидроксифенилсульфоновой кислоты. В конечном итоге, благодаря применению описанной здесь методики с гидроксифенилсульфоновой кислотой, были определены условия реакции для оптимизации морфологии наночастиц и плотности распределения углеводов на поверхности частиц.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими, такими как олигосахаридный синтез на твердой фазе, является существенно меньший расход строительных блоков. В данном методе обычно используются два или три эквивалента вместо 10–20 эквивалентов. Идея этого метода возникла у нас при демонстрации эффективности поверхностных эффектов и функционализации полигидронаночастиц с использованием углеводов для таргетирования рецепторов на антидентритных клетках. Затем мы решили разработать высокопроизводительную систему, которая позволила бы нам перебирать многочисленные параметры, участвующие в создании и применении этих новых носителей.

Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, поскольку разработка автоматизированных платформ для высокопроизводительного синтеза олигосахаридов и их прикрепления к полимерным частицам является новой областью исследований, по которой доступно немного документации. Перед автоматизированным синтезом дианной кислоты надлежащим образом защищенный сахарный донор, обычно трихлорацетамид, и акцептор, главным образом в форме фтористого спирта, синтезируются вручную и подготавливаются в хлорметане; также необходимо приготовить триметилсилилтрифторметансульфонат в хлорметане, 80% метаноле и 100% метаноле. Убедитесь, что относительная влажность воздуха в помещении и в камере автоматизации составляет 30% или ниже.

Высокая влажность воздуха отрицательно влияет на реакции гликозилирования. Следующие этапы выполняются с использованием автоматизированной платформы. Первое гликозилирование проводят с использованием донора и флористского спирта.

После завершения реакции полученную молекулу сахара с флор-меткой очищают методом FSPE. Затем временную защитную группу удаляют с помощью натрия, метоксида и метанола, после чего продукт снова очищают методом FSPE. Затем сахар с флор-меткой используют в качестве акцептора и связывают с тем же донором для получения дисахарида; полученный дисахарид очищают методом FSPE для дальнейшего использования.

Поместите реагенты, включая промотор донора-акцептора, 80%-й раствор метанола в воде, 100%-й метанол и метоксид натрия, в роботизированную платформу и запустите программу. Роботизированный манипулятор заберет донор, а затем акцептор из флаконов и перенесет их в реакционную пробирку. Затем смесь донора и акцептора перемешивают в течение 30 минут.

По истечении 30 минут роботизированный манипулятор переносит каталитический триметилсилилтрифторметансульфонат в смесь. Затем раствор перемешивают еще 30 минут. По завершении перемешивания программа приостанавливается.

Отберите аликвоту объемом 10 µL для проверки завершения реакции с помощью тонкослойной хроматографии. Если реакция завершена, пятно молекулы акцептора будет отсутствовать. Если реакция не завершена, акцептор на ТСХ будет по-прежнему виден.

В этом случае остановите программу, сбросьте время гликозилирования примерно до 30 минут и добавьте избыток промотора триметилсилилтрифторметансульфоната. По завершении реакции переходите к следующему этапу. После окончания реакции робот переносит реакционную смесь в картриджи FSPE, содержащие модифицированный силикагель C9 F17, для очистки.

Затем картриджи промывают восемью миллилитрами 80% methanol, а затем восемью миллилитрами 100% methanol. Для удаления фракции, не содержащей floris, промывную жидкость собирают в виалу для получения целевого продукта с меткой florist. Если требуется дополнительная очистка, остановите работу робота и извлеките соответствующие продукты реакции.

В зависимости от структуры доноры могут быть крайне инертными, и даже после добавления достаточного количества промотора часть молекул-акцепторов флориста может остаться не вступившими в реакцию. В таком случае FSPE будет недостаточно эффективным для очистки, и после проведения данной процедуры может потребоваться дополнительная очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле; после очистки роботизированный манипулятор дозирует метоксид натрия в реакционную пробирку. Затем смесь перемешивают в течение двух часов на роботизированной платформе; если, согласно данным ТСХ, реакция не завершилась, период инкубации продлевают примерно на один час.

После завершения реакции продукт очищают методом FSPE, как описано ранее. Затем продукт реакции извлекают из робота и на лабораторном столе растворяют в безводном толуоле с последующим выпариванием для удаления остаточной воды. После высушивания образца его возвращают в робот для повторения того же цикла, включая очистку продуктов гликозилирования методом FSPE.

Глубокая защита временной защитной группы с последующим гликозилированием повторяется до достижения желаемой длины цепи целевой молекулы. Для снятия защиты с продукта, полученного с помощью автоматизации, извлеките флакон из робота. Заключительные этапы процедуры включают использование взрывоопасного газообразного водорода и должны выполняться вне автоматизированной платформы. На лабораторном столе происходит озонолиз двойной связи в флуоресцентной метке с последующим окислением образовавшегося альдегида до карбоновой кислоты.

Очистите полученный продукт с помощью колоночной хроматографии на силикагеле на лабораторном столе, используя смесь 30% methanol в di chloro methane. В завершение, для снятия защиты с бензоэфирных групп путем гидрирования с палладиевым катализатором, пропустите продукт через фильтрующий слой (satellite pad), чтобы удалить палладий и получить чистый конечный продукт. Проведите полную характеристику продукта с помощью ядерного магнитного резонанса или ЯМР-спектроскопии.

Высокопроизводительный синтез полимеров и изготовление наночастиц осуществляются в соответствии с протоколом, описанным Петерсоном и соавт. Как указано в сопроводительном документе, автоматизированный аппарат для осаждения, используемый для функционализации частиц, состоит из трех насосов ne 1000, роботизированного стола, интегрированного с двумя актуаторами (один для перемещения в направлении X, другой — в направлении Y), и второго роботизированного стола с двумя соседними стойками, состоящими из трех актуаторов по одному на каждое направление; в общей сложности подключено пять актуаторов. Актуаторы и насосы, соединенные последовательно, управляются компьютером с помощью программного обеспечения LabVIEW.

Сополимерные системы, используемые для изготовления частиц, основаны на SEBA-кислоте или SA, а также на 1,6-бис(пара-карбоксифенокси)гексане (CPH) или 1,8-бис(пара-карбоксифенокси)-3,6-диоксаноксане (CPTeeg). После изготовления наночастиц установите штатив с центрифужными пробирками объемом 1,7 мл, содержащими библиотеку наночастиц, на платформу линейного актуатора для присоединения углеводов к поверхности полиангидридных частиц; при этом проводится реакция связывания через карбоксильную группу, состоящая из двух последовательных этапов. Для первой реакции заполните шприц в программируемом шприцевом насосе водным раствором EDC и этилендиамина в концентрациях 2 мг/мг наночастиц и 0,6 мг/мг наночастиц соответственно.

Заполните второй шприц в программируемом шприцевом насосе водным раствором частиц NHSA в концентрации 2.5 мг/мл, что составляет в общей сложности 12 эквивалентов на образец наночастиц. Затем с помощью программы LabVIEW дайте команду роботу внести суспензии реагентов в библиотеку наночастиц. После этого приводы робота переместят держатель пробирки в соответствующее положение на платформе для дозирования растворов EDC и NHS.

Активируйте карбоксильные группы на поверхности полиангидридных наночастиц для обеспечения среднего сопряжения. Затем погрузите ультразвуковой зонд в каждую пробирку и подвергните каждый образец воздействию ультразвука в течение 30 секунд при частоте 40 hertz. Перед переходом к следующему образцу очистите зонд ацетоном.

После того как все образцы будут насыщены, держатель для пробирок отделяют от роботизированной платформы. Инкубируют суспензии наночастиц в течение девяти часов при постоянном вращении и температуре 4 °C. Время проведения первой и второй реакций может быть изменено для регулировки конечной концентрации сахаридов.

После завершения реакции центрифугируйте пробирки при 12,000 ×g в течение пяти минут. В условиях охлаждения верните их на роботизированную станцию. Снова закрепите держатель для пробирок на роботизированном манипуляторе и заполните второй шприц в роботизированной платформе.

При использовании холодной воды первый шприц должен оставаться пустым. Запустите робота. Супернатант из каждой пробирки забирается в пустой шприц, а второй насос подает холодную воду в пробирки.

Этот этап проводится для удаления всех непрореагировавших реагентов из суспензий наночастиц. Затем гомогенизируйте суспензию наночастиц с помощью соникации, как было продемонстрировано ранее. После этого центрифугируйте пробирки при 12, 000 ×g в течение пяти минут.

Выполните вторую промывку холодной водой с помощью роботизированного аппарата. Для второй загрузки реакционной смеси поместите 12 эквивалентов EDC на образец наночастиц в первый насос и 12 эквивалентов NHS на образец наночастиц во второй насос. Запустите роботизированную платформу для дозирования соответствующих объемов в пробирки с наночастицами. Присутствие EDC и NHS обеспечит образование амидной связи между аминогруппами этилендитиола, уже прикрепленного к поверхности наночастиц, и карбоксильной группой глубоко защищенного сахара.

После завершения осаждения загрузите 10 эквивалентов конкретного сахарида. В данном случае использовались лактоза и гликолевая кислота в качестве контроля в двух имеющихся насосах. Каждый сахарид дозируется в пробирки в зависимости от требуемой функционализации для каждой пробирки, что предварительно программируется в программе LabVIEW, используемой для управления приводами и функциями насосов для конкретной реакции. В данном исследовании для присоединения углеводов в качестве контрольного линкера используется гликолевая кислота, так как глубоко защищенные сахариды уже имеют ковалентно связанную с ними эту молекулу, что позволяет осуществлять дальнейшее присоединение к поверхности наночастицы.

Суспензии наночастиц гомогенизируют путем соникации, как описано ранее, а затем инкубируют в течение девяти часов при постоянном вращении при температуре 4 °C. После инкубации суспензии наночастиц промывают путем центрифугирования с удалением супернатанта, затем ресуспендируют осадок в холодной воде и подвергают соникации; пробирки, содержащие теперь библиотеку функционализированных наночастиц, помещают в вакуумную камеру для высушивания минимум на два часа. Функционализированные наночастицы характеризуют методом динамического рассеяния света и другими методами для оценки состава поверхности, концентрации, размера частиц, распределения частиц по размерам и поверхностного заряда.

Полностью защищенная диано-сторонняя часть, показанная здесь, была синтезирована с использованием автоматизированной платформы. Синтезированное соединение было охарактеризовано методом ПМР-спектроскопии на спектрометре VXR 400 МГц. При использовании CDC 13 в качестве растворителя образование продукта может быть подтверждено по наличию нескольких характерных пиков.

На спектре ПМР четыре протона в диапазоне от 1.79 до 2.21 и два протона при 3.38 относятся к флорист-метке. Синглетный пик при 2.16 соответствует ацетатному пику, а пики при 4.94 и 5.11 — аномерным протонам. Для оценки влияния времени реакции на конечную морфологию наночастиц и степень присоединения сахаров наночастицы функционализировали с увеличением времени реакции, как показано здесь; концентрация диано на поверхности наночастиц 50 50 CPT CPH увеличивалась с общим временем реакции и достигла максимума через 18 часов.

Наночастицы, функционализированные при общем времени реакции 24 часа, затем использовали для оценки их способности воздействовать на CLR в дендритных клетках костного мозга мыши с помощью проточной цитометрии, как показано здесь. После стимуляции нефункционализированными, а также функционализированными лактозой и дано nanoparticles наблюдалось повышение экспрессии DC-SIGN и маннозного рецептора к C-типу лектиновых рецепторов. Это свидетельствует об эффективном таргетинге.

Однако частицы, функционализированные Diano, продемонстрировали более высокий уровень экспрессии, что указывает на специфичность этого лиганда к исследуемым рецепторам. После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить высокопроизводительный автоматизированный синтез олигосахаридов, а также функционализацию полинаночастиц. При использовании этих углеводных базисных таргетных агентов, после освоения синтеза защищенного донор-акцепторного сахара, сборка аппаратуры может быть осуществлена за 24–48 часов.

Разумеется, общая продолжительность процесса зависит от размера библиотеки, а также от времени функционализации. При использовании данного метода важно помнить, что условия реакции функционализации биоразлагаемых полигидрочастиц могут быть оптимизированы в зависимости от химического состава наночастиц. Следуя этой процедуре, можно синтезировать различные структуры углеводов для воздействия на определенные клеточные рецепторы с целью влияния на иммунологический ответ.