Высокая пропускная способность Single-камеру и несколько клеток микро-инкапсуляции

Применение методов, использующих клетки, инкапсулированные в каплях пиколитрового объема, часто было ограничено невозможностью контролировать количество клеток в каждой капле. В данном протоколе демонстрируется метод контроля инкапсуляции клеток путем сочетания двух различных микрофлюидных явлений: гидродинамического упорядочивания клеток и генерации капель в микросопле с фокусировкой потока. В вышележащем канале обеспечивается достаточно высокая скорость потока водного раствора с суспендированными клетками или частицами, что приводит к формированию цепочек с равными интервалами в направлении потока ниже по течению.

Сопло для генерации капель с фокусировкой потока используется для формирования водных капель с частотой в несколько килогерц в допустимой масляной несущей жидкости, стабилизированной поверхностно-активным веществом. Затем упорядоченные цепочки частиц в ячейках объединяются с процессом генерации капель путем настройки скоростей потоков водной и масляной фаз, чтобы обеспечить частоту генерации капель, синхронизированную с поступлением продольно упорядоченных клеток или частиц к соплу генерации капель, при этом частицы используются в качестве имитаторов клеток. Для демонстрации данного протокола скорости потоков должны быть достаточно малы, чтобы ограничить объем жидкости.

Сдвиговые напряжения, воздействующие на биологические клетки, перекрытие процессов упорядочивания клеток, генерации капель и жизнеспособности клеток. Ограничения по скорости водного потока обеспечивают идеальный рабочий режим для контролируемого инкапсулирования одиночных и нескольких клеток. Анализ данных видеомикроскопии показывает, что эффективность инкапсулирования одиночных и двойных клеток или частиц превосходит эффективность случайной инкапсуляции и значительно сокращает количество капель, не содержащих требуемого числа клеток или частиц.

Ограничение клеток и капель в замкнутом объеме препятствует разбавлению клеточных секретов, позволяет выявить клеточную гетерогенность, а также контролировать межклеточные сигналы по сравнению с объемной суспензией. Эффективные способы инкапсуляции таких клеток в капли предоставляют ценный инструмент для биологов. Для начала данной процедуры разработайте схему микроканалов в программном обеспечении AutoCAD, как показано на этом рисунке.

Длинный участок канала представляет собой канал упорядочивания водного потока шириной 27 микрон. На увеличенной схеме сопла показаны равные ширины каналов по 27 микрон для водного упорядочивающего канала и масляного канала, за которыми следует сужение сопла до 22 микрон и резкое расширение до более широкого канала шириной 61 микрон. Высота устройства составляет 52 микрон.

Как водный, так и масляный входы оснащены фильтрами для крупных частиц с зазорами порядка ширины упорядочивающего канала, что показано на данной увеличенной схеме масляного входа. Здесь представлено реальное изображение упорядочивающего канала и сопла, заполненных красителем. Для изготовления маски высокого разрешения используйте услуги стороннего производителя для печати на майларовой пленке или кварце, где каналы должны быть прозрачными на темном фоне.

Затем создайте мастер-форму из кремния и фоторезиста SU-8 для репликационного формования. Прикрепите мастер-форму скотчем к дну чашки Петри для репликационного формования PDMS. После завершения репликационного формования и вырезания контура устройства используйте биопсийный пробойник с внешним диаметром 0,75 millimeter для создания флюидных портов в трех круглых областях, показанных на данном рисунке; приклейте прозрачный скотч к стороне PDMS с рисунком и снимите его, чтобы удалить пыль после плазменного связывания.

Прикрепите PDMS к чистому стеклянному предметному стеклу микроскопа. Поместите все устройство в печь и постепенно нагрейте её до 120 °C. Оставьте устройство в печи при температуре 120 °C на ночь для завершения процесса склеивания и возвращения PDMS в исходное гидрофобное состояние.

Альтернативным методом придания гидрофобности стеклянной поверхности канала является введение покрытия, такого как aquae, в жидкостные порты с последующей продувкой воздухом. С помощью шприца объемом 1 мл и иглы наберите несколько сотен µL воздуха, а затем небольшое количество aquil, достаточное только для заполнения металлического наконечника шприца. Осторожно, но уверенно введите aquae, а затем продуйте жидкостные порты воздухом. Избегайте чрезмерного давления, чтобы не нарушить связь между PDMS и стеклом.

Повторите продувку воздухом всех входных и выходных портов, протирая излишки воды, чтобы избежать образования отложений, которые могут засорить каналы при высыхании. Контроль концентрации клеток необходим для достижения правильного количества клеток в каждой капле. Эта задача состоит из двух сложных компонентов.

Первым аспектом является предварительная оценка подходящей концентрации, а вторым — поддержание этой концентрации в ходе эксперимента. Для конкретного устройства, используемого в данном исследовании, для контролируемой инкапсуляции достаточно клеток или частиц размером от 8 до 15 микрон. В данной демонстрации в качестве имитаторов клеток будут использоваться полистирольные микросферы размером 9,9 микрон. Для подготовки водной суспензии частиц с концентрацией, обеспечивающей идеальную инкапсуляцию, начните с исходной концентрации микросфер 1% твердой фазы по массе, используя предыдущие данные для полной упорядоченности. В качестве рекомендации, увеличьте концентрацию до 1,5% твердой фазы, аккуратно центрифугируя один миллилитр исходного образца, удалив 250 µL супернатанта и повторно суспендируя частицы с помощью вортексного или более осторожного перемешивания.

При использовании клеток следует учитывать, что и клетки, и полистирольные частицы имеют относительную плотность более единицы, хотя в данном видео это не показано. Для длительных экспериментов, длящихся от многих минут до нескольких часов, плотность раствора можно привести в соответствие с плотностью объектов путем добавления такого растворенного вещества, как хлорид кальция для частиц или OptiPrep для клеток. После приготовления суспензии клеток или частиц приготовьте 10 мл образца непрерывной фторсодержащей масляной фазы в центрифужной пробирке объемом 15 мл и перемешайте на вортексе.

Смешайте поверхностно-активное вещество и фторсодержащее масло в соотношении примерно 2,5% по массе. В данном случае мы получили смесь с концентрацией 2,4% по массе, что допустимо для проведения эксперимента по микроинкапсуляции. Сначала включите питание инвертированного оптического микроскопа и высокоскоростной камеры.

Сфокусируйтесь на слое с микроканалами и проверьте каналы на наличие засоров и любых частиц мусора, которые могут сместиться. Выберите канал, свободный от крупных частиц или явных засоров. Отрежьте три отрезка полупрозрачной ПВХ-трубки Tigon для входа водной фазы, входа масла и выхода эмульсии, чтобы минимизировать мертвый объем.

Отрежьте трубку длиной, достаточной для соединения шприцевых насосов с микроскопом. Срежьте концы трубки под углом 45 градусов. Для облегчения установки используйте пинцет, чтобы плотно вставить концы трубок в жидкостные порты. Затем плотно вставьте тупоконечную иглу из нержавеющей стали калибра 30 в свободный конец трубки подачи водного раствора.

Повторите процедуру для трубки подачи масла. Переместите устройство и закрепите трубки на предметном столике микроскопа; с помощью объектива с 20-кратным увеличением совместите и сфокусируйте изображение на сопле устройства. Вручную настройте микроскоп по методу Кёлера для обеспечения оптимального освещения в фокальной плоскости.

С помощью программного обеспечения высокоскоростной камеры кадрируйте поле зрения вокруг сопла для обеспечения более высокой частоты кадров, затем установите частоту кадров, время экспозиции и другие настройки камеры, необходимые для оптимальной записи. Далее заполните одномиллилитровый шприц предварительно приготовленным и хорошо перемешанным раствором водной фазы. Заполните трехмиллилитровый шприц раствором масляной фазы.

Наклоните один из заполненных шприцев вертикально и постучите по нему, чтобы переместить пузырьки воздуха к выходному отверстию шприца. Медленно нажимайте на поршень до тех пор, пока воздух не выйдет через кончик шприца, удерживая шприц в вертикальном положении. Подсоедините шприц к соответствующей игле, уже установленной на устройстве.

Нажмите на поршень, чтобы вытеснить воздух из мертвого объема иглы шприца, пока жидкость не пройдет по трубке почти до самого устройства; надежно закрепите шприц в шприцевом насосе и зафиксируйте блок поршня. Повторите процедуру подключения для второго шприца и установите его во второй шприцевой насос; включите каждый насос и настройте программу работы. Согласно протоколам производителя, установите начальную скорость потока 50 µL/min для масляной фазы и 5 µL/min.

Для запуска водной фазы насосы работают до тех пор, пока каждая жидкость не поступит в устройство и не заполнит каналы, вытесняя остатки воздуха. При использовании начальных скоростей потока этот процесс может занять несколько минут. Наблюдайте за образованием капель на сопле.

Медленно увеличивайте скорость потока водной фазы, чтобы наблюдать упорядочивание частиц в длинном канале с водным раствором. По мере увеличения скорости потока следите за тем, чтобы она не достигла значений, при которых на сопле возникает струйный режим вытекания водной фазы, как показано в данном примере с использованием другого сопла для генерации капель; обратите внимание на нестабильный поток и неоднородность капель. Если концентрация частиц слишком мала для формирования чередующихся рядов с относительно небольшим количеством пропусков, а плотность образца не согласована с плотностью среды, физически наклоните шприцевой насос в сторону выходного отверстия шприца, чтобы обеспечить постепенное осаждение частиц к выходу из шприца.

После достижения надлежащего упорядочивания отрегулируйте скорость потока масла, чтобы настроить частоту генерации и размер капель. Итеративно корректируйте обе скорости потока для достижения требуемой степени инкапсуляции и объемов капель. После подтверждения стабильной упорядоченной инкапсуляции перенесите выходную трубку из резервуара для отходов в сборный резервуар для последующего использования.

Высокая эффективность может быть достигнута при инкапсуляции одиночных или двойных частиц или клеток. При использовании данного протокола показан репрезентативный результат инкапсуляции одиночных частиц при скорости потока масла 60 µL/min и скорости водного потока 9 µL/min. Лямбда (среднее количество частиц на каплю) составляет 0,95.

Расстояние между частицами в направлении потока составляет примерно 17–18 микрон для полностью упорядоченных чередующихся частиц. Скорость генерации капель в данном примере составляет 6,1 килогерц при среднем объеме капли 24,4 пиколитра. Гистограмма сравнивает эффективность инкапсуляции частиц в каплях при упорядоченном расположении для одиночной инкапсуляции частиц с плюсом.

Что касается статистики, при случайном инкапсулировании для выборки из 517 капель средняя доля капель, содержащих одну частицу, составляет 79,5% по сравнению с прогнозируемой долей случайного инкапсулирования 36,7%. Было замечено, что доля частиц, оказавшихся в правильно инкапсулированных каплях, составила 83,7% для выборки из 491 частицы, в то время как доля случайного инкапсулирования составила 37,3%. Инкапсулирование двух частиц достигается простым снижением скорости потока масла до 30 µL в минуту при сохранении скорости водного потока на уровне девяти µL в минуту. В данном случае лямбда, среднее количество частиц на каплю, составляет 1,8. Это аналогично инкапсулированию одной частицы.

Расстояние между частицами в направлении потока составляет примерно 17–18 микрон для полностью упорядоченных чередующихся частиц. Более крупные капли имеют средний объем 39.8 picoliters и формировались с частотой 3.8 kilohertz по сравнению со случайным инкапсулированием. Для выборки из 383 капель средняя доля капель с упорядоченным инкапсулированием, содержащих две частицы, составила 71.5% по сравнению с прогнозируемой долей при случайном инкапсулировании, которая составляет 26.8%. Было отмечено, что доля частиц, оказавшихся в правильно инкапсулированных каплях, составила 79.5% для выборки из 689 частиц, в то время как доля при случайном инкапсулировании составила 33.4%.

В совокупности эти результаты показывают, что эффективность инкапсуляции как одной, так и двух частиц более чем в два раза превышает эффективность случайной инкапсуляции и значительно сокращает количество капель, не содержащих требуемое число клеток или частиц. Важность правильных концентраций частиц или клеток для достижения высокой эффективности инкапсуляции проиллюстрирована в данном экспериментальном цикле. В то время как скорости потоков масла и водной фазы такие же, как при продемонстрированной ранее инкапсуляции двух частиц, среднее количество клеток на каплю lambda снижено до 1.57.

Следовательно, полное упорядочивание не происходит, и таким образом в цепочках возникают разрывы, в результате чего в каплях оказываются частицы в количестве меньшем, чем ожидалось. На данной гистограмме показано снижение эффективности инкапсуляции двух частиц из-за более низкого значения Lambda. Для выборки из 324 капель средняя доля капель, содержащих две частицы, составила 55.9%, при этом количество капель с одной частицей было почти таким же, как и капель с двумя частицами.

Это указывает на то, что Lambda должна быть равна или близка к количеству желаемых клеток в каждой капле для максимизации числа правильно инкапсулированных частиц или клеток с точно выбранным значением lambda, в зависимости от того, допустимо ли меньшее или большее количество клеток в капле. В данной демонстрации мы используем разницу в плавучести для обеспечения контроля концентрации в режиме реального времени в ходе эксперимента. Однако для более длительных экспериментов может быть целесообразно согласовать плавучесть для получения более стабильных результатов после инкапсуляции клеток в водные капли.

Эксперименты с изучением временной зависимости можно проводить в центрифужной пробирке или под микроскопом, повторно вводя капли в микрофлюидные массивы.