Комбинаторного синтеза и высокая пропускная способность белка Освобождение от полимерной пленки и наночастицы библиотеки

В данном видео описывается комбинаторный синтез библиотек биоразлагаемых полиангидридных пленок и наночастиц, а также высокопроизводительный анализ высвобождения белков из этих библиотек. Сначала используется высокопроизводительный автоматический аппарат для нанесения, с помощью которого в стеклянные кюветы помещается композиционно разнообразный набор мономеров. Реакция поликонденсации проводится при 180 °C и 0.3 tor в течение 1.5 часов.

Данные условия реакции специфичны для синтеза полиангидридного полимера C-P-H-S-A. С помощью автоматизированного аппарата для осаждения растворитель и любые компоненты для инкапсуляции вносятся в кюветы, содержащие библиотеку полимеров. Для обеспечения полного растворения полимера и равномерного распределения дополнительных компонентов может быть применена соникация.

Затем растворенный полимер переносят в пробирку с нерастворителем для создания библиотеки наночастиц методом нанопреципитации. Наночастицы выделяют путем вакуумной сушки или фильтрации, после чего переносят в модифицированный 96-луночный планшет для высвобождения. В завершение библиотеку с нагруженным белком инкубируют в физиологических условиях, а кинетику высвобождения белка оценивают с помощью метода флуоресцентного детектирования в пространстве.

В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие кинетику высвобождения белка в зависимости от свойств полимера или условий среды высвобождения. Основным преимуществом данного подхода по сравнению с другими традиционными методами анализа одного образца за раз является возможность одновременного синтеза нескольких образцов. Затем эти образцы могут быть подвергнуты высокопроизводительному скринингу для изучения взаимодействий белок-полимер, клетка-полимер или взаимодействий полимера с организмом хозяина.

Это ускоряет рациональный дизайн и разработку данных биоматериалов для доставки лекарств и тканевой инженерии. Процедуру продемонстрирует Ла Триша Питерсон, аспирантка из моей лаборатории. В данной части видео используется аппарат для высокопроизводительного осаждения с целью нанесения библиотеки мономеров с варьирующимся составом после синтеза полимеров.

Данный аппарат используется для создания комбинаторной библиотеки пустых или нагруженных белками полимерных пленок или наночастиц. Автоматизированная платформа состоит из двух программируемых шприцевых насосов и трех линейных актуаторов, подключенных последовательно к компьютеру. Для передачи команд на шприцевые насосы и актуаторы используется программное обеспечение LabVIEW.

Шприцы объемом 10 cc с газоплотным уплотнением устанавливают в шприцевые насосы с подключенными через фитинги Luer Lock металлическими капиллярными трубками, с помощью которых растворы полимеров дозируются в стеклянные кюветы. В данной демонстрации себациновая кислота (SA) будет использоваться совместно с 1,6-бис(пара-оксифенил)гексаном (CPH) для создания библиотеки наночастиц, инкапсулирующих сывороточный альбумин быка с меткой Texas Red. Инструкции в этом видео и сопроводительных документах могут быть адаптированы для изготовления и тестирования широкого спектра библиотек полимерных пленок и наночастиц.

Для синтеза библиотек начните с растворения каждого мономера в хлороформе до конечной концентрации 25 mg/mL в стеклянном флаконе. Затем перенесите каждый раствор в газоплотный шприц объемом 10 cc, аспирируя раствор через наконечник с люэр-замком. Удалите все пузырьки воздуха.

Затем прикрепите к концу шприца стойкую к растворителям капиллярную трубку из нержавеющей стали с Luer-Lock соединением. Закрепите капиллярные трубки в зажимах, прикрепленных к штативу. После этого поместите концы обеих капиллярных трубок в стартовую лунку.

Для нанесения мономера. Установите шприцы в программируемые шприцевые насосы и зафиксируйте их положение в программном обеспечении LabVIEW. Установите линейные актуаторы в начальное положение с помощью программного обеспечения.

Запустите автоматическое нанесение мономеров SA и CPH в стеклянные кюветы по осям x, y и Z. Актуаторы точно positioned капиллярные трубки в каждой кювете и перекачают в них запрограммированные объемы каждого мономера, создавая библиотеку мономеров с различным составом. После нанесения мономеров.

Перенесите библиотеку мономеров в предварительно нагретый вакуумный шкаф и инкубируйте при 180 °C и давлении 0,3 торр в течение 1,5 часов для проведения конденсационной полимеризации. После инкубации процесс изготовления библиотеки полимеров завершен. Далее создаются полимерные наночастицы, нагруженные белком.

Для создания библиотеки наночастиц, нагруженных белком, см. прилагаемый протокол изготовления библиотеки полимерных пленок, нагруженных белком. В данном случае добавьте белок, а именно Texas red bovine serum albumin, в соответствующий растворитель, который должен быть способен растворять полимерную библиотеку. Здесь используется methylene chloride в концентрации 2 mg/mL.

Заполните шприц объемом 10 cc растворителем, содержащим Texas Red BSA, и установите его в первый шприцевой насос. Затем поместите чистый пустой шприц объемом два cc во второй шприцевой насос, а пробирки, содержащие 15 мл нерастворителя (в данном случае пентана), установите в держатель для пробирок рядом с платформой для флаконов. После этого в программном обеспечении LabView запустите процесс автоматического осаждения растворителя, выбрав соответствующую программу.

После запуска программы растворитель подается в кюветы с библиотекой полимеров, в результате чего достигается концентрация полимера 20 mg/mL. После подачи всего объема растворителя дайте полимеру раствориться в течение одной-пяти минут. После этого можно провести необязательное перемешивание для обеспечения полного растворения полимера и равномерного распределения белков.

Затем запустите программу переноса образцов в LabVIEW. Каждый растворенный образец полимера из библиотеки втягивается в пустой шприц и дозируется в соответствующую пробирку с нерастворителем в держателе для образцов. После переноса всех образцов выделите наночастицы с нагруженным белком, поместив библиотеку наночастиц в вакуумную камеру при вакууме 10 мм рт ст или используя вакуумную фильтрацию до полного удаления растворителя.

Для исследования высвобождения инкапсулированного BSA используйте глубокий 96-луночный полипропиленовый планшет, модифицированный путем удаления верхней части стенки (примерно 1,3 см) каждой лунки в каждой второй соседней колонке планшета. Удаление верхней части каждой лунки между колонками A и B, C и D, E и F, а также G и H обеспечивает ток жидкости между каждой парой смежных лунок при заполнении до полного объема переноса. В глубокий 96-луночный планшет внесите стандарты Texas red BSA в концентрации от 1000 до 10 µg/mL.

Они будут использоваться для расчета количества белка, а также для учета тушения флуорохрома; восстановите желаемую массу наночастиц в PBS-буфере, затем подвергните их ультразвуковой обработке для равномерного распределения частиц. Далее перенесите библиотеку наночастиц в глубокий 96-луночный планшет и подождите, пока образцы осядут на дно лунок. Затем с помощью пипетки медленно заполните все соседние лунки PBS-буфером, оставив примерно одну четверть дюйма до верхнего края лунки.

В соседних лунках должно быть достаточно буфера для обеспечения его свободного перетекания между ними. Затем закройте планшет для высвобождения крышкой и поместите его при температуре 37 °C в условиях перемешивания. На протяжении всего эксперимента через определенные промежутки времени сканируйте планшет с помощью плоскостного флуоресцентного сканера Typhoon 9 400, используя соответствующие фильтры возбуждения, лазера и эмиссии.

После сканирования используйте программное обеспечение для количественного анализа изображений, чтобы определить количество высвобожденного белка, конъюгированного с флуорохромом, при каждом высвобождении. Для определения кинетики высвобождения белка в зависимости от химического состава полимера Texas Red BSA был инкапсулирован в библиотеку полимерных наночастиц, синтезированных из мономеров SA и CPH, как описано в данном видео. Наночастицы с нагруженным белком инкубировали при 37 °C в течение одного месяца, в течение которого проводили флуоресцентное сканирование через определенные промежутки времени для количественного анализа высвобождения белка.

Как показано здесь, данный метод гидропропускной способности был использован для определения кинетики высвобождения Texas Red BSA из библиотеки полиангидридных наночастиц A-C-P-H-S-A. Наблюдались зависимости, обусловленные химическим составом: скорость высвобождения возрастала при использовании химических составов пленок Сарича. Аналогичные результаты были получены при использовании стандартных методов количественного определения белков.

В отдельном эксперименте оценивали высвобождение Texas Red BSA из библиотек полиангидридных пленок CPT CPH, как показано здесь: наблюдалась кинетика высвобождения, близкая к нулевому порядку, при этом пленки с высоким содержанием cpeg высвобождали белок наиболее быстро, что открывает возможности применения в медицине в качестве биоразлагаемых устройств для доставки лекарственных средств. Эти результаты указывают на то, что требуемый профиль высвобождения терапевтического препарата или вакцинного антигена можно регулировать, изменяя химический состав полимера. После применения данной процедуры были разработаны другие комбинаторные методы для исследования таких аспектов, как стабильность белков, клеточная токсичность, клеточная активация и биораспределение InVivo.

Эти аспекты имеют важное значение для рационального проектирования биоматериалов для доставки лекарств и тканевой инженерии. Не забудьте надеть соответствующие СИЗ и соблюдать правила техники безопасности в лаборатории на протяжении всего данного протокола.