Полимеразной цепной реакции: основные протокол Plus Устранение неполадок и оптимизация стратегии

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать этапы полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая используется для получения достаточного количества определенного сегмента ДНК из малого объема исходного материала. Сначала подготовьте реагенты и материалы, которые будут использоваться в ПЦР, затем создайте реакционную смесь, включающую четыре дезоксирибонуклеотида, матричную ДНК, праймеры и ДНК-полимеразу. Затем запрограммируйте условия термического циклирования и запустите ПЦР.

После этого проверьте результаты, чтобы определить, прошла ли реакция успешно. В конечном итоге полимеразная цепная реакция должна дать специфический ампликон желаемого размера продукта.

Как правило, люди, которые впервые используют данный протокол, могут столкнуться с определенными трудностями при расчете количества каждого из переменных реагентов, а также иногда с дозированием правильных объемов, особенно в случае с полимеразой, содержащей глицерин. Начните эксперимент с подготовленного ведра со свежим льдом. Используйте перчатки, чтобы избежать контаминации реакции.

Смесь и реагенты. Разместите компоненты ПЦР на льду для полного размораживания. К ним относятся матричная ДНК, праймеры, ДНК-полимераза, 10-кратный реакционный буфер с хлоридом магния или без него, дезоксинуклеотиды, стерильная вода и хлорид магния.

Хлорид магния необходим при использовании буфера без хлорида магния. Поместите планшет на 96 лунок в контейнер со льдом, чтобы использовать его в качестве держателя для тонкостенных ПЦР-пробирок объемом 0.2 мл. Теперь подготовьте на рабочем столе ПЦР-пробирки и крышки к ним.

Стойка для ПЦР-пробирок, спиртостойкий маркер и набор микродозаторов. Всегда составляйте таблицу реагентов с подробным описанием реакционной смеси, добавляя стерильную дистиллированную воду до достижения конечного объема 50 µL. Например, используя 5 µL буфера без магния, 1 µL 10 mM dNTP и оптимизированное содержание магния 4,0 mM.

Один µL каждого из 20 µM праймеров, 0,5 µL матрицы в концентрации 2 нг/µL и 0,5 µL полимеразы; в таком случае потребуется добавить 33 µL стерильной воды. Добавьте хлорид магния, если он отсутствует в 10-кратном буфере или если это необходимо для оптимизации ПЦР.

Промаркируйте ПЦР-пробирки для каждой реакции, используя спиртостойкий маркер. Сначала добавьте рассчитанный объем стерильной воды, затем 10-кратный буфер и 10 мМ dNTP. В данной реакции мы проводим титрование хлорида магния.

Поскольку концентрация магния не будет постоянной, хлорид магния добавляют в ПЦР-пробирки индивидуально, и объем доводят стерильной водой до 10 µL, чтобы в каждую ПЦР-пробирку было добавлено 40 µL конечной мастер-смеси. Для завершения приготовления 50 µL реакционной смеси с хлоридом магния добавьте ДНК-матрицу и праймеры. Наконец, добавьте от 0,5 до 2,5 единиц ДНК-полимеразы на 50 µL реакции в микроцентрифужную пробирку объемом 1,8 мл.

Приготовьте раствор мастер-микса в объеме, достаточном для проведения контрольных реакций, а также с учетом потерь при переносе дозатором. Установите микропипетку примерно на половину общего объема раствора и аккуратно перемешайте содержимое путем пипетирования. Для каждого исследуемого образца внесите мастер-микс в ПЦР-пробирку.

Теперь для отрицательного контроля без матричной ДНК добавьте все реагенты, используя стерильную воду для компенсации объема отсутствующей ДНК. Затем для положительного контроля используйте набор матричной ДНК и праймеров, которые амплифицируют известный фрагмент в тех же условиях, что и экспериментальные образцы ПЦР. Термоциклеры для ПЦР быстро нагревают и охлаждают реакционную смесь, обеспечивая индуцированную теплом денатурацию дуплекса, отжиг праймеров к плюс- и минус-цепям матрицы ДНК и элонгацию продукта ПЦР.

Время циклов определяется по общей формуле в зависимости от размера матрицы и содержания ГЦ-пар в ДНК. Начните с начальной денатурации матрицы, затем запустите от 25 до 35 раундов трехэтапной программы температурного цикла. Первый этап этих циклов предназначен для денатурации матрицы ДНК.

Затем установите оптимальную температуру отжига праймеров — примерно на пять градусов Цельсия ниже их расчетной температуры плавления, после чего следует этап элонгации для приведения полимеразы к матрице ДНК и синтеза ПЦР-продукта. Теперь введите количество циклов. Затем переходите к следующей программе.

Удлиненный этап элонгации для завершения синтеза ампликонов. В завершение добавьте этап терминации, охладив смесь до 4 °C. Если стандартные условия ПЦР не позволяют получить желаемый ампликон, для достижения лучших результатов необходима оптимизация ПЦР.

Таким образом, если реакции не удались с первого раза, следует попытаться выявить и устранить причины проблемы. Прежде всего необходимо убедиться, что причиной не стала ошибка оператора. Это может произойти в случае ошибки при дозировании с помощью пипетки или если вы забыли добавить реагент в одну из пробирок.

Далее можно попробовать изменить некоторые параметры строгости условий, скорректировав настройки термоциклера, или в качестве альтернативного метода изменить концентрацию магния. Для поиска и устранения проблем также можно попробовать добавить в реагент определенные добавки. Кроме того, рассмотрите возможность использования ПЦР с «горячим стартом» как универсакой модификации, при которой время начальной денатурации значительно увеличивается.

Затем используют гель-электрофорез AROS для анализа ПЦР-продуктов гена GAL three из геномной ДНК S seia с целью определения оптимальной концентрации ионов магния для данного набора реагентов; отметьте, что ПЦР-продукт ожидаемого размера 2098 п.н. появляется начиная с концентрации магния 2,5 мМ, при этом оптимальная концентрация составляет 4 мМ. При амплификации различных матриц ДНК для получения желаемого ПЦР-продукта в виде четкой полосы требуется 2 мМ магния. Снижение строгости реакции до фактически субоптимальных условий амплификации приводит к образованию шмера из неспецифических продуктов.

Кроме того, при общем снижении строгости условий реакции для формирования ампликона требуется меньшее количество ионов магния. Таким образом, оптимизация ПЦР с учетом всех переменных позволяет получить конкретный желаемый продукт. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как организовать и подготовить полимеразную цепную реакцию.

Цель состоит в том, чтобы понять переменные каждой ПЦР и то, как ими можно манипулировать для создания желаемого ампликона.