Количественный анализ рабочих процессов Фитнес

Целью данной процедуры является количественное определение приспособленности микробных культур в параллельном режиме в масштабе всего генома с высокой точностью и пропускной способностью. Это достигается путем предварительного создания библиотеки массивов микробных колоний в 96-луночных планшетах и выращивания культуры до состояния насыщения. Затем насыщенные культуры разводят в воде и наносят каплями на чашки с твердым агаром.

Затем чашки с твердым агаром периодически фотографируют до тех пор, пока рост микробной колонии не достигнет насыщения. В конечном итоге фотографии временного хода роста каждой культуры преобразуются в количественные показатели плотности клеток, а наблюдаемые кривые роста сопоставляются с моделями роста и количественными показателями приспособленности микроорганизмов. В итоге можно получить результаты, свидетельствующие о генетических взаимодействиях, продемонстрировав, что штаммы микроорганизмов обладают разной приспособленностью либо при сочетании с различными мутациями, либо при выращивании в разных условиях.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как методы высокоплотного прикрепления (например, SGA) или эксперименты по конкуренции штрих-кодов, является более высокая точность измерения приспособленности. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области разработки противоопухолевых препаратов, например, определить, какие гены и процессы играют важную роль в ответе на повреждение ДНК и контроле клеточного цикла, а также помочь в понимании и переносе результатов таких исследований на модельных микроорганизмах для выявления потенциальных мишеней для лекарственных средств в раковых клетках человека. Кроме того, данный метод позволяет получить представление о функции теломер и визи.

Этот метод также может быть применен в других областях биологии дрожжей или в любой сфере, где фенотипы приспособленности могут дать представление о биологии микроорганизмов. Мы надеемся, что QFA может быть использована для многих других микроорганизмов, для которых существуют библиотечные массивы. Например, povi e coli, orilla surplus. Начиная с насыщенных ночных культур, были высеяны до 96 независимых штаммов дрожжей в объемах 200 µL богатой жидкой среды.

В 96-луночном культуральном планшете стерилизуют 96-контактный ручной репликатор диаметром 1/8 дюйма, сначала погрузив его в 100% ethanol, затем обжигая его в пламени и давая ему остыть. В лунки 96-луночного планшета наносят по 200 µL стерильной воды; затем насыщенные дрожжевые культуры, предварительно перемешанные на вортексе, разводят, трижды погружая стерильный инструмент-репликатор в каждую из культур. После этого инструмент один раз погружают в лунку с водой, снова стерилизуют и дают ему остыть, прежде чем трижды погрузить его в разведенные культуры. Затем полученные образцы переносят на чашку с плотным агаром.

После инкубации чашек с агаром используйте сканер s and p robotics SP для их ручного сканирования с целью последующего автоматизированного культивирования. Начните с прямоугольного массива независимых штаммов дрожжей, выращенных на твердом агаре. В данном примере исходные штаммы получены в результате скрещивания температурно-чувствительной искомой мутации с коллекцией делеций дрожжей.

1 536 культур, представляющих четыре повторности 384 независимых штаммов дрожжей, выращивают на чашках SGA с использованием робота со стерильным 96-штыревым инструментом (диаметр штыря 1 мм); переносят 384 из 1 536 штаммов в 4 культуральные планшеты на 96 лунок, содержащие 200 µL селективной среды, и выращивают культуры при 20 °C до достижения насыщения. Для нанесения насыщенных культур дрожжей их сначала переносят на робот для работы с жидкостями и ресуспендируют на магнитном шейкере; затем культуры разводят примерно до 1:70, используя стерильный 96-штыревой роботизированный инструмент для переноса в 200 µL стерильной воды.

После очистки и стерилизации инструмента-пина нанесите разведенные культуры на агаризованные среды. В формате 384 лунок перенесите планшеты в увлажненный термостат с автоматической каруселью и смотровым люком. Для визуализации культур используйте роботизированный автоматический имиджер, который многократно извлекает планшеты из инкубатора, снимает крышки, переносит их в зону с равномерным освещением под 35-миллиметровую камеру и делает снимок с разрешением 5184 на 3456.

Pixel resolution возвращает крышку на место, затем помещает планшеты обратно в карусель инкубатора для отслеживания расположения культур на планшетах и примененных к ним воздействий. Планшеты автоматически маркируются штрихкодами в соответствии с названием инкубатора, температурой, уникальным порядковым номером партии и положением в инкубаторе. Имена изображений представляют собой объединение названия планшета и временной метки и генерируются автоматически при захвате изображения.

Планшеты также часто маркируют вручную, чтобы они оставались в том же порядке при перемещении между каруселями робота. Файлы метаданных представляют собой текстовые файлы с разделителем-табуляцией, которые создаются вручную. Файл с описанием эксперимента FT two.

Таблица один уникальна для каждого эксперимента, однако описание библиотеки FT three, таблица один может использоваться многократно. После создания эксперимент описывается в файле с описанием эксперимента FT two, таблица один, который содержит столбцы для штрих-кода или автоматически сгенерированного названия планшета, временной метки начала эксперимента, обработки планшета, состава твердой агаровой среды, названия скрининга, номера планшета библиотеки для библиотек из нескольких планшетов, а также номера повторного квадранта для масштабирования из формата 1 536 лунок в формат 384 лунок. Библиотека штаммов e описывается в файле с описанием библиотеки FT three, таблица один, в котором указан генотип, выращенный в каждой культуре.

Каждый планшет библиотеки содержит четыре столбца: название библиотеки, ORF, номер планшета, строку и столбец планшета, а также необязательный столбец для примечаний. Дополнительно может быть предоставлен файл со стандартными названиями генов (FT four, таблица 1), в котором указано стандартное название гена, соответствующее каждому систематическому номеру ORF, для идентификации скринингуемых штаммов. Этот файл содержит два столбца — ORF и название гена — для анализа данных.

Вычислительный рабочий процесс QFA требует доступа к достаточно мощной многоядерной компьютерной рабочей станции, на которой установлено соответствующее ПО. Инструмент для анализа изображений colonizer и пакет QFAR, документация к которым доступна в Интернете, предоставляются бесплатно и работают в различных операционных системах. Запустите colonizer, используя каждое из полученных изображений планшета в качестве входных данных, создавая один выходной файл colonizer для каждого полученного изображения; выходные файлы colonizer содержат оценки плотности культуры, площадь, форму и цвет культуры.

Для каждой из 384 позиций на предметном стекле имя выходного файла автоматически копируется из имени исходного файла изображения. Пакет QFAR содержит функции для обработки временных рядов каждой культуры с целью подбора обобщенных логистических моделей роста популяции по результатам наблюдений и их последующего построения на графике. Примеры представлены на рисунках два и три.

Оптимизированные значения параметров записываются в файлы логистических параметров QFA. Пакет QFAR также содержит функции для контроля качества. Краевые колонии отбраковываются из-за большей доступности питательных веществ по краям планшета и сложностей при анализе изображений.

Культуры, расположенные у стенок планшета, образцы, не прошедшие SGA-скрининг, и генотипы, проявляющие сцепление со специфическими маркерными генами скрининга, исключаются из анализа. На основе параметров логистической модели популяции для каждой культуры рассчитываются несколько количественных показателей приспособленности. К ним относятся максимальная скорость удвоения популяции и число делений от момента инокуляции до насыщения для каждого набора повторов и для каждого определения приспособленности.

Вычисляются несколько сводных статистических показателей оценок приспособленности: среднее и медианное значения приспособленности, стандартное отклонение приспособленности и количество наблюдаемых повторностей. Сводные статистики выводятся в файлы сводок по приспособленности QFA FT eight, table one для дальнейшего анализа. Например, для расчетов показателей генетического взаимодействия FT nine table one.

На этом рисунке представлена типичная кривая роста в логарифмическом масштабе при использовании 384-луночного QFA. Культуры, растущие при 20 °C на твердом агаре, количественно оценивались с помощью Colonizer; увеличение плотности клеток стало заметным примерно через два дня. Эта задержка, вероятно, является комбинированным эффектом лаг-фазы культуры после инокуляции на твердую среду и нижнего предела обнаружения плотности клеток.

Здесь представлены 308 схожих кривых роста, полученных с одного планшета. Обратите внимание, что штаммы, кривые роста которых представляли собой прямую линию, были сильно повреждены или погибли. На данном рисунке показано сравнение двух полногеномных скринингов QFA для определения силы генетических взаимодействий.

Пакет QFAR также включает функции для построения вышеупомянутого графика кривой роста и вывода ранжированных списков исследованных генотипов и оценок силы генетического взаимодействия. Вместе с этим предоставляется значение Q для определения значимости наблюдаемого GIS. После освоения метода полный полногеномный эксперимент QF.A с четырьмя повторностями может быть завершен в течение трех недель. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости систематического подхода к отслеживанию и именованию всех планшетов и изображений.

Все планшеты должны быть инокулированы и размечены в правильной ориентации и последовательности. Анализ данных зависит от точности вспомогательных текстовых файлов, созданных исследователем. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как оценивать приспособленность тысяч независимых микробных культур.

Показатели приспособленности оценивают путем многократного фотографирования капельных культур, выращенных на плотных агариковых средах, преобразования полученных изображений в оценки плотности клеток и построения кривых роста. Математическое моделирование кривых роста позволяет получить количественные оценки приспособленности, которые затем могут быть использованы для выведения функциональных взаимосвязей между продуктами генов в масштабе всего генома.