Оценка репликации и функции бета-клеток в Adenovirally-трансдуцированных изолированных островков грызунов

Основная цель данной процедуры заключается в выявлении сигнальных путей, регулирующих изменения функциональной массы бета-клеток. Это реализуется в изолированных островках Лангерганса крыс путем гиперэкспрессии или подавления экспрессии определенного гена с использованием аденовирусных векторов. После проведения данной манипуляции функция бета-клеток оценивается по секреции инсулина, а репликация островков — по включению тритиевого тимидина.

В конечном итоге, данные анализы позволяют определить, регулирует ли интересующий ген пролиферацию и/или функцию бета-клеток in vitro. Этот метод помогает ответить на ключевые вопросы в области биологии век, например, влияет ли определенный компонент сигнального пути на рост и функцию бета-клеток. Подготовьте 6-луночный планшет без покрытия для культивирования тканей, добавив по 2 мл модифицированной среды в необходимое количество лунок.

Например, для типичного эксперимента может потребоваться три лунки: одна для контрольной группы без вируса, одна для контрольной группы с вирусом и одна для экспериментальной группы. Прогрейте планшет при температуре 37 °C в инкубаторе для культур тканей в течение не менее 30 минут. Сразу после изоляции глазков крысы поместите от 1 до 200 глазков в каждую лунку подготовленного планшета. 60 глазков будут использованы для биохимического анализа, а остальные — для исследований экспрессии генов или иммуноблоттинга. Осторожно покачайте планшет, чтобы сосредоточить глазки в центре каждой лунки.

Затем сразу же нанесите аденовирус пипеткой непосредственно на эксплантаты (eyelets) в центре чашки. Используйте кратность заражения (MOI) от 1 до 500 в зависимости от эффективности аденовируса в гиперэкспрессии или нокдауне вашего целевого белка.

Эффективное проникновение аденовируса в глубокие слои века повышает воспроизводимость результатов. Крайне важно проводить трансдукцию век сразу после их изоляции.

Не тревожьте планшет в течение пяти минут, затем поместите его в инкубатор на 24 часа. На следующий день извлеките планшет из инкубатора и осторожно переместите экспланты (глазки) в центры лунок. Перенесите экспланты в новую лунку со свежей средой с помощью микропипетки на 200 µL.

Если люверсы прилипнут к планшету, их можно осторожно отделить кончиком пипетки. Для проверки достаточной эффективности трансдукции полезно использовать контрольный вирус, экспрессирующий GFP, применяя конфокальную микроскопию для визуализации проникновения аденовируса в культуру ядер островков. Культивируйте островки еще от одного до трех дней, ежедневно меняя среду.

Время культивирования должно быть оптимизировано в ходе предварительных исследований и варьируется в зависимости от целей эксперимента. В течение последних 24 часов добавьте в среду тритиевый тимидин в концентрации 1 мкКи на миллилитр среды. Сначала приготовьте 50 мл рабочего раствора SAB в конической пробирке объемом 50 мл и прогрейте его на водяной бане при 37 °C.

Пипеткой перенесите 10 мл рабочей среды SAB в коническую пробирку объемом 15 мл и добавьте 66,8 мкл 2,5 М D-глюкозы. Для приготовления среды SAB с высоким содержанием глюкозы добавьте 44,8 мкл 2,5 М D-глюкозы в оставшиеся 40 мл рабочей среды SAB. Для подготовки среды SAB с низким содержанием глюкозы промаркируйте три микроцентрифужные пробирки объемом 1,7 мл.

В каждую лунку планшета на шесть лунок добавьте по 1 мл PBS. Не забудьте соблюдать институциональные протоколы по обращению с радиоактивными глазками и их утилизации. Используя стереоскоп или стандартный микроскоп, отберите и перенесите по 20 глазков сопоставимого размера в каждую микроцентрифужную пробирку.

Например, в каждой пробирке может содержаться по пять малых, 10 средних и пять больших по размеру глазков. Хотя в конце эксперимента результаты нормируются по общему содержанию белка, критически важно обеспечить соответствие размеров глазков между группами. После того как глазков осядут на дно пробирки под действием силы тяжести или центрифугирования, аспирируйте и взвесьте PBS с помощью микропипетки, а затем приступайте к подготовке глазков для биохимических анализов.

Для подготовки островков к анализу секреции инсулина их необходимо предварительно инкубировать в SAB с низким содержанием глюкозы. Для этого добавьте 400 µL SAB с низким содержанием глюкозы в пробирки и поместите их с закрытыми крышками в инкубатор для культур тканей на 60 минут. Через час аспирируйте SAB с низким содержанием глюкозы, использованный для предварительной инкубации. Для измерения базальной секреции инсулина повторите процедуру предварительной инкубации.

Однако для измерения стимулированной секреции инсулина используйте 400 µL SAB с высоким содержанием глюкозы вместо SAB с низким содержанием глюкозы и, как и прежде, инкубируйте островковые клетки в течение 60 минут; после этого аспирируйте SAB с высоким или низким содержанием глюкозы и используйте его для радиоиммунологического анализа инсулина, который проводится согласно протоколу производителя. Затем приступайте к анализу включения тимидина, используя ту же группу островковых клеток. Начните с тех клеток, которые только что использовались для анализа секреции инсулина.

Добавьте 1 mL PBS и дайте глазкам осесть под действием силы тяжести. Затем аспирируйте PBS с помощью микропипетки. Удалите жидкость и повторите этот шаг еще раз.

Затем добавьте 500 µL ледяной трихлоруксусной кислоты в глазные яблочки и инкубируйте их на льду в течение 30 минут. Центрифугируйте пробирки при температуре 4 °C. После этого удалите TCA путем аспирации.

Затем добавьте 80 µL 0,3 N раствора гидроксида натрия и инкубируйте глазковые диски в течение 30 минут при комнатной температуре. Во время инкубации интенсивно перемешивайте образцы на вортексе от 5 до 10 секунд каждые 10 минут. Параллельно добавьте 4 мл коктейля для подсчета Conno Safe в пробирки для жидкостного сцинтилляционного счета объемом 7 мл.

По окончании инкубации глазков перенесите 50 µL суспензии глазков в сцинтилляционную пробирку. Кратковременно встряхните закрытую пробирку и измерьте радиоактивность образцов на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Также для определения концентрации белка перенесите 10 µL образцов в коммерческий набор для анализа с биониковой кислотой и следуйте протоколу производителя.

Впоследствии при анализе данных нормализуйте результаты по концентрации белка, используя описанные протоколы. Репликация островков и функция бета-клеток. В островках крыс была оценена аденовирусная гиперэкспрессия гипотетического гена six, которая значительно стимулировала репликацию островков без изменения функции бета-клеток.

Повышенная экспрессия гена six привела к усилению синтеза ДНК, что было определено по включению тимидина, так как большинство клеток островков крысы являются бета-клетками. Дальнейшие эксперименты могли бы показать, что данное увеличение включения тимидина обусловлено усилением репликации бета-клеток. Анализ секреции инсулина показал, что сверхэкспрессия гена six не изменила одну из основных функций бета-клеток — секрецию инсулина при низком и высоком уровнях глюкозы.

Увеличение секреции инсулина при низких и высоких концентрациях глюкозы отражает состояние островков после обработки аденовирусом. Если повышение экспрессии гена six нарушает функцию бета-клеток, это, вероятно, проявится в виде снижения секреции инсулина при высоких стимулирующих концентрациях глюкозы. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как измерять репликацию бета-клеток и секрецию инсулина, чтобы определить, влияет ли конкретный ген на рост или функцию бета-клеток.