Моделирование колит, связанного с раком Azoxymethane (ОСО) и декстран сульфат натрия (DSS)

В нулевой день мышам вводили азоксиметан или OM на следующей неделе. Питьевая вода заменяется раствором, содержащим декстрансульфат натрия или DSS. На третьей неделе мышам дают обычную воду в течение следующих двух недель.

Данный цикл введения DSS повторяют еще дважды. После второго цикла DSS у мышей проводят обследование на наличие опухолей с помощью зеркальной эндоскопии.

После 10-й недели мышей усыпляют и извлекают толстые кишки. Толстые кишки промывают и вскрывают продольным разрезом. Проводится оценка размера и количества опухолей в толстой кишке.

Продольный разрез толстой кишки, разделенный на три части, можно залить в парафин и направить на гистологический анализ. С помощью световой микроскопии можно подсчитать количество опухолей и классифицировать их. Мы демонстрируем протокол, включающий введение генотоксического агента OM с последующими тремя циклами применения провоспалительного агента.

DSS быстро и стабильно вызывает образование опухолей толстой кишки у мышей, которые морфологически и молекулярно схожи с опухолями при раке, ассоциированном с колитом у людей. На нулевой день промаркируйте каждую мышь с помощью меток на хвосте или вырезов на ушных раковинах, зафиксируйте исходный вес каждой мыши в таблице, затем введите каждой мыши раствор OM в дозе 10 mg/kg. Соблюдайте осторожность при работе с OM, так как это генотоксичный агент. На седьмой день обеспечьте животных питьевой водой с 2,5% раствором DSS в течение следующей недели. Для приготовления данного раствора добавьте порошок DSS в дистиллированную воду и перемешайте до полного растворения.

Раствор считается готовым после фильтрации через целлюлозоацетатный фильтр с порами 0,2 мкм. Это обеспечит непрерывную подачу раствора DSS в течение семи дней. Заменяйте DSS каждые два-три дня.

После этого периода верните мышей в клетки с водой на две недели. Взвешивайте мышей два-три раза в неделю и наблюдайте за наличием ректального кровотечения и диареи. У мышей с крупными опухолями может временно развиться выпадение прямой кишки, хотя обычно это не снижает процент выживаемости.

Потеря веса относительно исходного уровня используется в качестве суррогатного показателя тяжести колита. В течение недели после полного цикла введения DSS может наблюдаться потеря веса до 10% в сочетании с диареей и ректальным кровотечением в течение двух-трех дней. Вторым или третьим циклом DSS можно подтвердить рост опухоли in vivo перед жертвованием животных.

Поскольку модель A-O-M-D-S-S достаточно надежна в плане индукции опухолей, этот этап обычно не требуется. Данным методом следует оценивать лишь нескольких мышей, так как он может привести к повреждению опухолей. В вашей рабочей зоне должны находиться стакан со стерильным фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), а также пустой стакан.

Чтобы удалить использованный PBS, наберите в шприц от 8 до 10 мл PBS и подсоедините его к эндоскопу перед каждым использованием. Для промывания внутрипросветного содержимого проведите анестезию каждой мыши путем ингаляционной или инъекционной седации и зафиксируйте мышь на плоской доске с помощью ленты в области хвоста и груди; подушечки лап мыши можно зажать. Чтобы убедиться в достаточной седации, используйте большой и указательный пальцы, чтобы сжать нижнюю часть живота мыши для обнажения ануса, после чего введите эндоскоп Muren в прямую кишку мыши.

Осторожно используйте PBS для раздувания и ирригации, чтобы улучшить обзор просвета кишечника и удалить фекальное содержимое. Продолжайте медленно продвигать эндоскоп, наблюдая за монитором. К 70-му дню, при наличии макроскопических опухолей, у каждой мыши, получавшей A-O-M-D-S-S, должно быть несколько опухолей толстой кишки, готовых к оценке.

Этот этап можно отложить на несколько недель или месяцев, если требуются более крупные опухоли. Подготовьте шприц, заполненный PBS, с установленной иглой для зондирования. Шприц с 10% формалином, базовые хирургические ножницы, ножницы с закругленными концами.

Небольшой шприц, заполненный 1% раствором Ian Blue, и тонкий пинцет. Также подготовьте охлажденный лоток, лодочку с охлажденным раствором PBSA, новое лезвие для секционирования и фиксирующую ванночку, заполненную 10% формалином. Эвтаназируйте каждую мышь с помощью изофлурана и цервикальной дислокации или другого одобренного учреждением метода. Можно провести финальное взвешивание и другие измерения.

Теперь положите мышь на разделочную доску брюшной стороной вверх. Опрыскайте область живота 70% ethanol, чтобы шерсть не попадала в зону диссекции. С помощью пинцета захватите кожу по средней линии живота и сделайте небольшой разрез, чтобы обнажить брюшину.

Осторожно потяните кожу, чтобы отделить её от брюшины и обнажить всю брюшную полость. Сделайте разрез брюшины и продлите его вдоль реберных краев с обеих сторон. С помощью закрытых ножниц отодвиньте тонкий кишечник и ободочную кишку в сторону.

Это позволит обнажить брыжеечные лимфатические узлы, которые при необходимости можно извлечь. Для проведения оценки сместите органы мочеполовой системы в каудальном направлении, чтобы обнажить нисходящую часть ободочной кишки и прямую кишку; при необходимости иссеките мочевой пузырь и репродуктивные органы для дальнейшего обнажения органов малого таза. Действуйте осторожно, чтобы не повредить прилегающие ткани.

Перережьте нижнюю и верхнюю ветви лобковой кости, чтобы обнажить переход анального канала в прямую кишку. Разрежьте кожу вокруг перехода анального канала в прямую кишку, чтобы высвободить ободочную кишку, осторожно приподнимая ее. С помощью мезентериальных пинцетов можно иссечь или аккуратно отделить прикрепления ободочной кишки.

Важно сохранить часть кожи в области анально-ректального перехода, так как эта область часто поражается дисплазией. Пересеките толстую кишку в месте ее соединения с тонкой кишкой проксимальнее слепой кишки. Отделите слепую кишку от прилегающей части ободочной кишки, используя зондовую иглу 18 калибра, прикрепленную к шприцу объемом 5 мл.

Промойте ободочную кишку ледяным PBS так, чтобы жидкость выходила в физиологическом направлении, используя ножницы с закругленными концами. Разрежьте ободочную кишку вдоль брыжейки. Разложите вскрытую кишку на холодном лотке.

Убедитесь, что лоток достаточно оттаял, чтобы ткань не замерзла. Нанесите несколько капель 1% Ian Blue пальцем для лучшей визуализации опухолей. Определите количество и размер опухолей с помощью линейки или сделайте фотографии для последующего цифрового анализа.

На данном этапе для последующего анализа методами исследования РНК, белков или иммуногистохимического анализа можно вырезать небольшие фрагменты опухоли с прилегающей нормальной тканью, оставив часть толстой кишки для гистологической оценки. С помощью шприца или пальца нанесите 10% формалин на оставшуюся часть толстой кишки, лежащую на холодном подносе, и дайте ткани зафиксироваться в течение как минимум 30 секунд. Такой подход облегчает перенос образца в емкость для фиксации.

Перед тем как приступать к окрашиванию новой вскрытой ободочной кишки на том же подносе, убедитесь, что остатки формалина удалены. Перенесите ободочную кишку в кювету, наполненную 10% формалином, и зафиксируйте ее по краям булавками. После трех часов фиксации слейте формалин и замените его 70% этанолом.

Ободочные кишки можно бессрочно хранить в 70% ethanol. Используя слабый нагрев, приготовьте 2% раствор agar и подготовьте чистое предметное стекло на стеклянной пластине. Разрежьте фиксированную ободочную кишку на три части, а неиспользованные фрагменты верните в емкость с ethanol.

С помощью двух лезвий обрежьте фрагменты до одинакового размера. Поместите фрагменты и слои толстой кишки в агар на чистом предметном стекле. Повторите этот процесс для следующей части толстой кишки.

Отрежьте сегмент, удалите излишки агара и поместите имплантированную толстую кишку в кассету для дальнейшей обработки и окрашивания гематилином и эозином. На рисунке 1 представлена схема протокола индукции рака, ассоциированного с колитом. На рисунке 2 показано изменение массы тела мышей относительно исходного уровня в ходе введения OM и DSS.

Обратите внимание, что в течение недели после каждого цикла введения DSS мыши теряют от 5 до 10% массы тела. Потеря веса в данном эксперименте служит суррогатным маркером тяжести колита. На рисунке 3 представлен вид опухолей в дистальном отделе ободочной кишки, полученный с помощью эндоскопии мышей на 50-й день лечения по схеме A-O-M-D-S-S.

Обратите внимание на множественные полипоидные образования, обтурирующие просвет дистального отдела ободочной кишки на панелях B и C по сравнению с нормальной ободочной кишкой. На панели a рисунка 4 показана продольно вскрытая ободочная кишка мыши, демонстрирующая макроскопический вид опухолей. Отметьте более высокую опухолевую нагрузку в дистальном отделе ободочной кишки и характерную текстуру проксимального отдела с незначительным ростом опухоли.

На рисунке 5 представлены опухоли, выделенные с помощью окрашивания lc и синим красителем. Обратите внимание, как краситель подчеркивает нормальную текстуру толстой кишки, а также границы каждой отдельной опухоли. Такое окрашивание может быть полезным для точного измерения площади опухолей с помощью линейки или цифровым методом.

На рисунке 6 показано репрезентативное распределение среднего количества опухолей на одну мышь, подвергнутую воздействию OM и DSS. Обратите внимание, что большинство опухолей локализованы в дистальном отделе толстой кишки и имеют размер менее двух миллиметров. На рисунке 7 представлены парафиновые продольные срезы толстой кишки в кассете и препарат, окрашенный гематоксилином и эозином.

Обратите внимание, что остатки S и синего красителя не препятствуют окрашиванию гематоксилином и эозином. На изображении препарата обведена большая опухоль. Обозначения «дистальный», «средний» и «проксимальный» получены в результате разделения всей толстой кишки на три равные части на отрезке от слепой кишки до ануса.

На рисунке 8 представлена репрезентативная гистология опухоли в дистальном отделе толстой кишки, возникшей в результате введения OM и DSS. Представленные микрофотографии окрашены H и E-B-R-D-U и бета-катенином; на них видны диспластические изменения, сходные с аденокарциномами толстой кишки у человека. В данном видео мы продемонстрировали протокол индуцированного воспалением колоректального туморогенеза у мышей с использованием однократной инъекции OM с последующими тремя семидневными циклами введения DSS.

В течение 10-недельного периода данная модель индуцирует опухоли с гистологическими и молекулярными изменениями, тесно напоминающими те, что происходят при раке, ассоциированном с колитом у человека, и представляет собой крайне ценную модель для изучения онкогенеза и химиопрофилактики этого заболевания.