Твердофазный синтез функционализированных Бис-пептида Использование «Безопасность Поймать« Методология

Общая цель данного эксперимента заключается в синтезе функционализированного BSP-пептида с использованием методов твердофазного синтеза. Это достигается путем нагрузки защищенной BIS-аминокислоты на смолу с гидроксиэтиламинобензойной кислотой. Затем повторяются циклы сопряжения с глубокой защитой для присоединения функционализированных бис-аминокислот, что приводит к удлинению BIS-пептида и обеспечению требуемой функциональности.

Наконец, первая бис-аминокислота модифицируется альфа-аминокислотой для отщепления BIS-пептида от смолы путем образования DI-кетопиразина. Полученные результаты демонстрируют успешный синтез функционализированного BSP-пептида с хорошей чистотой сырого продукта и стабильным выходом выделенного вещества примерно 10% согласно анализу методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии. Возможности данной методики распространяются на параллельный синтез и создание библиотек бис-пептидов, поскольку BIS-пептиды собираются на твердой смоле, что позволяет легче управлять процессом по сравнению с реакциями в растворе, а побочные продукты легко удаляются путем фильтрации.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как многие этапы трудно освоить из-за большого количества важных деталей, необходимых для того, чтобы все реакции протекали максимально полно. При твердофазном синтезе очистка промежуточных соединений невозможна. Поэтому для получения чистого конечного продукта каждую реакцию необходимо доводить до максимально возможной степени завершения.

Мы рекомендуем составить контрольный список экспериментальных процедур, чтобы избежать путаницы, так как этапы носят повторяющийся характер. Данный протокол начинается с загрузки первого пептида BSP, защиты первого пептида BSP и одновременного блокирования (кэпинга) смолы. Для начала загрузите первый пептид BSP, отвесив 114 мг смолы H-M-B-A-A в реакционный сосуд объемом 8 мл, и добавьте магнитный перемешиватель.

Закройте верхнюю часть сосуда резиновой септой и продуйте трубку аргоном в течение не менее пяти минут. Тем временем приготовьте раствор активированной аминокислоты BIS, как описано в письменном протоколе. После завершения действий, показанных в данном видео, перенесите раствор в реакционный сосуд с помощью шприца и перемешивайте под аргоном в течение ночи; на следующий день снимите септу и слейте реакционную смесь.

Промойте смолу, добавив к ней примерно две миллилитры хлорметана. Перемешивайте от 30 секунд до одной минуты, затем слейте жидкость. Повторите эту процедуру четыре раза с DCM, после чего промойте смолу пять раз диметилформамидом.

Для проведения глубокого снятия защиты с первой бис-аминокислоты и одновременного блокирования концов полимерной матрицы медленно добавьте в реакционный сосуд 2 mL раствора 33% hydrogen bromide в уксусной кислоте и DCM. Перемешивайте в течение 15 минут, после чего слейте раствор и пять раз промойте смолу в DCM. Повторите последовательность снятия D-защиты еще один раз.

Затем промойте смолу пять раз в DCM, после чего пять раз в DMF; нейтрализуйте смолу, дважды промыв ее 5% (об/об) раствором D-I-P-E-A в DMF. Затем снова промойте пять раз DCM и пять раз DMF. Теперь можно приступить к сочетанию защищенной функционализированной бис-аминокислоты.

Сначала снова создайте инертную атмосферу в реакционном сосуде с смолой, промыв его трижды безводным DCM. Затем установите септум и линию продувки аргоном, промойте сосуд, добавив от одного до двух миллилитров безводного DCM, и перемешивая в течение 30 секунд. После этого слейте содержимое сосуда до тех пор, пока в барботере линии аргона не начнут появляться пузырьки.

Повторите этот процесс еще как минимум один раз. Затем приготовьте раствор функционализированной бис-аминокислоты в пробирке, высушенной в пламени, в атмосфере аргона. Добавьте 47 µL DIC и перемешивайте в течение 90 минут.

Затем добавьте к смоле 35 мкл D-I-P-E-A в 666 мкл безводного DMF и перемешивайте еще пять минут. Перенесите предварительно активированный раствор BIS-аминокислоты в сосуд с помощью шприца и перемешивайте в течение ночи до следующего дня. Слейте реакционную смесь и дважды промойте безводным DCM в токе аргона.

Критическим этапом данной процедуры является связывание двух аминокислот. Чтобы обеспечить замыкание кольца дикетопиперазина, мы используем более длительное время реакции с применением дополнительных активирующих агентов. Для стимулирования замыкания дикетопиперазина добавьте раствор HOAT и DIC и перемешивайте под аргоном в течение одного часа.

Затем извлеките септу и слейте реакционную смесь. Промойте смолу пять раз ДХМ и пять раз ДМФА. В данном разделе рассматриваются глубокая защита функционализированной BIS-аминокислоты, глубокая защита Fmoc и ацилирование первой BIS-аминокислоты.

Для проведения глубокой защиты функционализированной бис-аминокислоты медленно добавьте в реакционный сосуд два миллилитра раствора TFA и TIPS и перемешивайте в течение одного часа; после слива промойте смолу DCM в течение примерно 30 секунд, затем снова слейте жидкость и повторите промывку DCM пять раз. Затем повторите всю последовательность промывки смолы после глубокой защиты согласно схеме A-D-C-M-D-M-F. Нейтрализуйте смолу, дважды промыв ее 5% об. раствором D-I-P-E-A в DMF.

Затем проведите еще одну промывку по схеме D-C-M-D-M-F. После этого пептид BIS можно удлинить с помощью других функционализированных бис-аминокислот, функционализировать по ведущему азоту, карбоксильной группе или по обоим центрам. Для снятия защиты с группы FM добавьте два миллилитра 20% раствора пиперидина в DMF и перемешивайте реакционную смесь в течение 20 минут.

Слейте жидкость и пять раз промойте смолу в DMF. Повторите этот процесс еще один раз после дополнительной промывки смолы. В качестве заключительного этапа изолируйте первую бис-аминокислоту, добавив подготовленный раствор аминокислоты в реакционный сосуд, и перемешивайте в течение шести часов.

Промойте смолу пять раз ДХМ и пять раз ДМФА. Заключительный этап данного протокола включает удаление группы Баха из связанной со смолой аминокислоты и отщепление от смолы. Сначала добавьте два миллилитра раствора ТФУ-ДХМ в соотношении 1:1 в реакционный сосуд и перемешивайте в течение 30 минут.

Слейте жидкость и пять раз промойте смолу в DCM. Затем повторите этот процесс еще раз. Промывайте и сливайте жидкость со смолы в течение 30 секунд: пять раз с использованием DCM и пять раз с использованием DMF.

Затем добавьте два миллилитра 10% раствора D-I-P-E-A в безводном DMF и перемешивайте от 24 до 48 часов. В завершение перенесите реакционную смесь в предварительно взвешенную круглодонную колбу. Перенесите 30 µL этого раствора в 450 µL Tetra Hydro FU в пробирку для LC-MS и отправьте на анализ.

Промойте смолу дополнительными порциями DMF и соберите промывные воды в круглодонную колбу. Для мониторинга химических превращений на смоле в ходе синтеза можно использовать следующие методы. Для обнаружения свободных гидроксильных групп проведите тест с метиловым красным, предварительно отобрав примерно один миллиграмм сухой смолы одноразовой пипеткой.

Перенесите содержимое в реакционный сосуд объемом 4 мл. Добавьте раствор метилового красного, приготовленный согласно описанию в тексте, и перемешивайте от 5 до 10 минут. Слейте жидкость и промойте смолу дихлорметаном (DCM) пять раз; оранжевый или красный цвет гранул смолы указывает на наличие свободных гидроксильных групп.

Данный тест может быть использован для оценки эффективности загрузки первой бис-аминокислоты и этапов блокировки смолы. Чтобы выявить вторичные аминогруппы, проведите хлоральный тест, перенеся примерно один миллиграмм сухой смолы в небольшой флакон с помощью одноразовой пипетки. Добавьте по три капли 0.8 миллимолярного раствора хлораля в DMF и 2% раствора кислотного альдегида в DMF.

Оставьте раствор при комнатной температуре на 5–10 минут. В данном случае синие или фиолетовые смоляные гранулы указывают на наличие свободных вторичных аминов в связанном с полимером соединении. Для подтверждения эффективности активации проведите тест с ловушкой для активации; степень активации соединения в процессе синтеза можно оценить, перенеся 5–10 µL активированного раствора в виалу для жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии, содержащую 50 µL оламина, и перемешав вручную.

В течение нескольких секунд раствор должен окраситься в желтый цвет, затем его следует разбавить 450 µL тетрагидрофурана и отправить на LC-MS анализ. Конечный продукт и активированные промежуточные соединения можно оценить с помощью системы LC-MS, оснащенной обращенно-фазовой колонкой C 18 и системой растворителей вода/ацетонитрил с 0,1% муравьиной кислоты. Данный график LC-MS-UV служит примером высокой чистоты сырого продукта.

Установлено, что основной пик в спектре на 21,3 минуте имеет массу, соответствующую ожидаемой массе продукта. Это можно увидеть на масс-спектре неочищенного продукта, где пик демонстрирует основные максимумы, соответствующие массе продукта, массе продукта плюс масса иона натрия, а также массе продукта минус масса защитной группы IV DDE. Здесь представлен УФ-хроматограмма LCMS очищенных спектров, демонстрирующая очень чистый продукт на 21,3 минуте, и масс-спектр, подтверждающий идентичность этого пика очищенного тримера.

После просмотра данного видео вы должны хорошо понимать, как использовать методы синтеза на твердой подложке для получения функционализированных бис-пептидов после их разработки. Данный метод открыл исследователям в области бис-пептидов путь к изучению их применения в белок-белковых взаимодействиях и катализе. При должном освоении и правильном выполнении эта методика позволяет синтезировать функционализированный тример бис-пептида за четыре-пять дней.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости постоянного погружения гранул в реакционные и промывочные растворы на протяжении всего процесса. Для получения ответов на дополнительные вопросы, например, о влиянии стереохимии или альтернативных функциональных групп на связывание белков или каталитическую активность, могут быть использованы другие методы, такие как параллельный синтез или синтез библиотек. Не забывайте, что работа с органическими реагентами может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, включая использование соответствующих средств индивидуальной защиты и работу в вытяжном шкафу.