Поколение, очистка и характеристика Cell-инвазивных видов белка DISC1

Общая цель следующих процедур заключается в получении очищенных дисков. Один из них должен быть способен проникать в реципиентные клетки. С помощью первого метода будут продемонстрированы два различных способа достижения этой цели.

Флуоресцентный белок с формированием соме-подобных структур, слитый с белком disc one, сверхэкспрессируется в донорских клетках нейробластомы человека NLF. Затем клетки промывают PBS, собирают и лизируют без использования детергентов. ДНК подвергают расщеплению, а агрозоны очищают с помощью системы градиента плотности сахарозы.

Агреосы, очищенные этим методом, обладают низкой эффективностью проникновения в клетки. Альтернативный подход заключается в гиперэкспрессии аминокислот с 598 по 785 рекомбинантного белка disc 1 в e coli. Затем фрагмент белка метят DITE 5 94, подвергают диализу и очищают с помощью матрицы NI NTA, которая удаляет весь оставшийся несвязанный краситель и мультимерный disc.

Фрагменты, полученные этим методом, обладают высокой эффективностью инвазии в клетки, что позволяет оценивать инвазию в клетки-хозяева. Для этого используются либо очищенные диски с флуоресцентным белком, либо рибосомы, либо меченые рекомбинантные диски. Фрагменты инкубируют с соответствующими клетками-реципиентами.

Затем добавляют трипан синий для тушения внеклеточной флуоресценции, после чего инвазию визуализируют с помощью конфокальной микроскопии. До настоящего времени агрегация белков не считалась характерным признаком хронических психических заболеваний, таких как шизофрения. В случаях, когда при шизофрении нарушается один конкретный белок, он становится кандидатом на изучение, так как инвазивность белковых агрегатов в клетки является отличительной чертой конформационных болезней белков.

В данной работе мы с помощью двух методов демонстрируем, что агрегаты белка DISC1 способны проникать в клетки, и, следовательно, расстройства, связанные с DISC1, или нейропатии DISC1 являются заболеваниями, вызванными нарушением конформации белков. Эти два метода включают, во-первых, очистку полноразмерного белка DISC1 из клеточных линий нейробластомы и, во-вторых, экспрессию С-концевого мультимерного фрагмента DISC1 в E. coli с последующей очисткой и мечением флуоресцентным красителем.

В то время как первый метод приводит к низкой эффективности инвазии клеток, при которой очищенные микросомы поглощают лишь около 0,3% клеток, чистый рекомбинантный фрагмент белка инфицирует до 20% подвергнутых воздействию клеток. Описанные здесь методы должны быть применимы и к другим белкам, для которых было убедительно продемонстрировано формирование акросомы или мультимерная сборка. В каждой из чашек Петри диаметром 10 сантиметров.

Высейте 1,5 × 10⁶ клеток нейробластомы человека и клеток LF в дополненную среду RPMI 1640 и культивируйте в течение ночи. На следующий день клетки должны достичь 70–80% конфлюэнтности. Подготовьте пять чашек для трансфекции с помощью pCDNA 3.1 mRFP и EGFP-меченым полноразмерным белком DISC1 человека и пять чашек для трансфекции только с плазмидой EGFP. Для каждой 10-сантиметровой чашки смешайте 15 мкг плазмидной ДНК, 30 мкл Metafect и 750 мкл.

Добавьте Opti MEM в микроцентрифужную пробирку, перемешайте путем многократного пипетирования и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем для трансфекции клеток по каплям добавьте к ним раствор реагента для трансфекции ДНК. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO₂. Через 48 часов после трансфекции проконтролируйте экспрессию полноразмерного mRFP-disc1 и подтвердите образование агрезомов с помощью флуоресцентного микроскопа. В некоторых клетках наблюдаются массивные включения флуоресцентного белка, как показано здесь.

Данный протокол объединяет метод очистки телец Леви из тканей головного мозга и протокол выделения более крупных агрегатов или агрозон; поскольку существующие методы основаны на использовании детергентов, выделение белков, не содержащих детергентов, имеет решающее значение для применения в анализах инвазивности клеток. Далее аспирируют среду, промывают PBS и добавляют 400 µL PBS, содержащего коктейль ингибиторов протеаз. Затем клетки снимают скребком, и 1 мл клеточной суспензии вместе с 10 керамическими шариками переносят в пробирку для лизиса объемом 2 мл.

Проведите лизис клеток, используя три импульса на гомогенизаторе pre-cell lyse 24. Механическое воздействие в ходе этого процесса может привести к повышению температуры образца выше 37 °C, поэтому следует обеспечить охлаждение образца на льду. После процедуры лизиса и последующего охлаждения клеток на льду добавьте 10 mM хлорида магния, 40 U/mL ДНКазы и инкубируйте в течение 60 минут при 37 °C с перемешиванием.

Приготовьте по 10 миллилитров 80%, 50% и 20% растворов сахарозы (масса/объем) в PBS. Затем в конической пробирке объемом 15 миллилитров подготовьте градиент сахарозы, последовательно добавив два миллилитра 80% сахарозы, два миллилитра 50% и два миллилитра 20% сахарозы. Наливайте градиент медленно, стараясь не нарушить уже сформированные слои.

Затем нанесите переваренный лизат поверх градиента и центрифугируйте в течение 15 минут при 1000 ×g при температуре четыре градуса Цельсия. После остановки центрифуги аккуратно соберите пипеткой интерфейс между слоями 50–80% сахарозы, перенесите в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл, добавьте пять объемов буфера и центрифугируйте в течение 15 минут при 1000 ×g при температуре четыре градуса Цельсия. Осторожно удалите супернатант и сохраните осадок, содержащий зону агрегации.

Повторите промывку еще два раза в этом интерфейсе. Агри-зоны флуоресцируют, и после последнего этапа промывки их можно визуализировать под микроскопом в УФ-свете; удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 250–500 мкл PBS. Этот осадок содержит очищенные агри-зоны.

Добавьте по 10 µL суспензии соматосом MRFP-disc1 в каждую лунку 24-луночного планшета, содержащего клетки нейробластомы человека SH-SY5Y, конститутивно экспрессирующие растворимый GFP-disc1 C-terminus, на стерильных стеклянных покровных стеклах, и инкубируйте в течение 48–72 часов. После инкубации промойте клетки трижды с помощью PBS и погасите внеклеточную флуоресценцию 0,04% раствором трипан синего в течение пяти минут.

Затем промойте PBS, чтобы удалить трипан синий. Далее поместите чашку на лед, добавьте 4%PFA и PBS и выдержите 10 минут для фиксации клеток. Затем однократно промойте стерильной водой и закрепите покровные стекла на предметных стеклах с использованием среды для монтажа DPI prolonged gold.

Подтвердите поглощение при инвазии экзогенно введенных агрегзомов путем колокализации с рекрутированными белками, экспрессируемыми клетками-реципиентами, на Z-стеках. Данный Z-стек охватывает глубину примерно 6 мкм.

24 снимка, сделанных с шагом 200 nanometers. Флуоресценция agri-зоны диска one MRFP, показанная красным цветом, привлекает цитозольный терминальный диск GFPC. Один фрагмент, показанный зеленым цветом, при колокализации выглядит желтым, что указывает на проникновение agri-зон в цитозоль реципиента и привлечение ранее растворимого белка диска one.

В этой части протокола диск 1 человека будет помечен DITE 5 94. Это позволяет осуществлять прямой мониторинг рекомбинантного белка без необходимости дополнительного иммуноокрашивания. Начните с очистки белка, подготовленного согласно описанию в сопроводительном документе, от β-меркаптоэтанола путем трехкратного диализа в двух литрах PBS при разведении 1:2000.

Замаркируйте диск 1 массой 1 mg как DITE 5 94 IDE. Растворите белок в PBS до концентрации 1 mg/mL и добавьте 5 mM TCEP для восстановления свободных SH-групп. Добавьте к реакционной смеси 20 µL красителя, растворенного в DMF, и инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре. Используя диализную кассету SLI с пределом отсечения по молекулярной массе 10,000 Da, проведите диализ белка в PBS трижды при соотношении 1:2000 по два часа за один цикл, чтобы дополнительно повысить чистоту меченого белка.

Проводится аффинная очистка с использованием His-тега на колонке с Ni-NTA. Промойте 1 мл матрицы Ni-NTA 10 мл PBS, затем нанесите меченный диализованный белок на колонку и дайте ему пройти через нее.

Раствор будет постепенно терять синий цвет из-за связывания белка с матрицей NTA; несвязанный свободный краситель останется в проскоке. После ввода раствора белка в колонку промойте её трижды 20 миллилитрами PBS. Для элюции белка добавьте в колонку два миллилитра PBS, содержащего 500 millimolar имидазола.

Установите клапан на низкую скорость потока и проводите элюцию по каплям, контролируя перемещение окрашенной полосы в колонке с Ni-NTA. Данная окрашенная фракция элюата содержит меченый рекомбинантный белок; перенесите элюат в диализную кассету SLI и проведите диализ элюата трижды против 10 мМ NAPI при разведении 1:2000 по два часа каждый раз в двух литрах. После диализа пропустите элюат через стерильный шприцевой фильтр с порами 0,45 мкм, затем разлейте по пяти пробиркам по 100 µL и подвергните мгновенной заморозке в жидком азоте.

Общее количество белка в каждой аликвоте объемом 100 µL должно составлять от 0,5 до 1 µg/mL. Для оценки инвазивности белка добавьте в каждую лунку 24-луночного планшета, содержащего реципиентные клетки нейробластомы человека SH SY 5Y, экспрессирующие растворимый GFP-тег C-конца белка disc one на стерильных стеклянных покровных стеклах, среду, содержащую от 5 до 10 µg/mL меченого рекомбинантного белка disc one. Инкубируйте в течение 48–72 часов.

Погасите внеклеточную флуоресценцию, зафиксируйте и смонтируйте клетки так же, как это было сделано для клеток, обработанных в агри-зоне; подтвердите инвазию экзогенно внесенного рекомбинантного белка с помощью Z-стек визуализации. При поглощении меченого белка он обнаруживается в пределах периметра реципиентных клеток на изображениях, полученных с помощью конфокальной микроскопии. Этот Z-стек охватывает глубину примерно 5 µm при 24 шагах по 220 nm.

Здесь рекомбинантный фрагмент Disc1 с 598 по 785 аминокислотный остаток, показанный красным цветом, поглощается реципиентными клетками, экспрессирующими растворимый C-терминальный GFP-меченный Disc1, показанный зеленым цветом, для определения инвазивности агрегатов белка Disc1. Агрозоны, состоящие из полноразмерного Disc1 с меткой MRFP, были очищены из клеток NLF и добавлены реципиентным клеткам SH-SY5Y, как описано в данном видео. Агрозома Disc1 с меткой MRFP проникла в клетку нейробластомы человека SH-SY5Y, экспрессирующую растворимый C-терминальный Disc1 с меткой GFP.

Кроме того, MRFP-меченый агрегат (asome) белка disc one был способен привлекать растворимый GFP-меченый disc one в нерастворимые агрегаты. Для определения инвазивности DIA-меченый рекомбинантный disc one был добавлен к клеткам нейробластомы SH-SY5Y, экспрессирующим растворимый GFP-disc one, как показано здесь. Рекомбинантный белок disc one-мальтоз, показанный красным цветом, проник в клетку-реципиент; желтые точки указывают на привлечение растворимого GFP-меченого C-концевого disc one в агрегаты. Меченый рекомбинантный disc one, экспрессированный и очищенный из e coli, также проявил инвазивность по отношению к нейронам in vivo при стереотаксическом введении мультимерного белка в медиальную префронтальную кору крысы. Z-стек визуализации подтверждает наличие рекомбинантного белка disc one в кортикальных нейронах крысы, окрашенных антителами к нейрональным ядрам.

Мы только что продемонстрировали вам два метода получения агрегатов белка disc1 для изучения инвазии клеток. Используя любой из этих методов, мы можем исследовать клеточные эффекты поглощения агрегатов disc1 без потенциально искажающих факторов, связанных с экспрессией рекомбинантных генов путем трансфекции чужеродной ДНК. Эти методы могут быть применены для изучения биологических эффектов патологии белка disc1 in vitro в культуре клеток и in vivo путем интрацеребрального введения или другими способами введения на моделях животных.

Мы уверены, что данные методы могут быть перенесены и на другие белковые агрегаты при условии внесения незначительных модификаций в протокол в зависимости от конкретного белка. При выполнении данной процедуры обязательно выделите достаточное время для тщательного анализа изображений, полученных с помощью конфокальной микроскопии.