Подготовка, очистка и характеристика комплексов лантанидов для использования в качестве контрастных агентов для магнитно-резонансная томография

Общая цель данной процедуры заключается в синтезе, очистке и характеристике лантаноидных комплексов, которые могут быть использованы для маркировки биологических макромолекул. Это достигается путем первоначального смешивания исходного материала металла и лиганда при контроле pH раствора. Вторым этапом процедуры является очистка полученного комплекса с помощью диализа.

Затем необходимо подтвердить отсутствие свободного металла. Заключительным этапом процедуры является определение свойств комплекса, имеющих значение для визуализации. В итоге, путем измерения релаксационной активности, можно получить результаты, подтверждающие, что синтезированные комплексы будут проявлять свойства контрастных веществ.

Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов в области визуализации, например, меняется ли координационное число воды контрастного агента при связывании с белком. Как правило, лицам, которым необходим этот метод, будет сложно его реализовать, поскольку тщательный контроль pH приведет к тому, что LI станет бесполезным для биообразования. Демонстрация диализа и измерений активности будут проведены Будой и Саши.

Аспиранты из моей лаборатории. Для начала процесса метилирования с использованием солей лантаноидов сначала растворите один эквивалент лиганда в воде, чтобы получить раствор с концентрацией от 30 до 265 мМ. В данной работе лиганд Paraiso Benzyl DTPA используется в концентрации 73 мМ. Затем доведите pH раствора лиганда до значения от 5,5 до 7, добавляя 1 М гидроксид аммония.

В данном видео 0,2 мл одного молярного раствора гидроксида аммония используется для растворения одного-двух эквивалентов хлорида лантаноида в воде с целью получения раствора с концентрацией от 5 до 1000 мМ. В концентрации 111 мМ может быть использован либо хлорид европия, либо хлорид гадолиния. Часто используют избыток металла, чтобы довести реакцию до конца и, следовательно, упростить очистку.

Затем, при перемешивании, добавьте каждый раствор солей лантана к приготовленному раствору лиганда. Теперь доведите pH полученных реакционных смесей до значения от 5,5 до семи, добавляя 0,2 молярный гидроксид аммония. Для корректировки раствора используется в общей сложности 0,5 миллилитра 0,2 молярного раствора гидроксида аммония.

Если используемый лиганд содержит кислоточувствительные функциональные группы, корректируйте pH несколько раз в ходе данного этапа. Будьте осторожны при регулировании pH, так как при чрезмерном защелачивании раствора любые щелочечувствительные функциональные группы, такие как изотиоцианат, станут непригодными для использования. В процессе конъюгации внимательно контролируйте реакцию путем измерения pH.

Реакция считается завершенной, когда значение pH остается постоянным. Для лигандов, не содержащих чувствительных к основаниям функциональных групп, может быть также полезен этап очистки, включающий повышение pH. Для начала очистки методом диализа определите подходящую длину диализной трубки, чтобы она вмещала объем образца, плюс дополнительную длину для размещения еще 10% объема образца. Затем, следуя инструкциям производителя, обрежьте трубку до этой длины.

В данном видео использовалась мембрана с порогом отсечения молекулярной массы от 100 до 500 Дальтон, однако при необходимости можно использовать трубки с более высоким порогом отсечения, если конъюгация проводится до метирования. Если это предусмотрено рекомендациями производителя, вымочите отрезанную диализную трубку в воде в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем наполните резервуар для диализа водой, которая будет служить диализатом. В данном случае используется стакан объемом один литр.

Объем диализата должен примерно в 100 раз превышать объем образца. Теперь дважды сложите один конец трубки и зафиксируйте загнутую часть зажимом для диализа. Обмотайте конец зажима резинки, чтобы он оставался закрытым в процессе диализа.

Профильтруйте предварительно подготовленную реакционную смесь через фильтр с порами 0,2 микрона. Затем загрузите фильтрат в открытый конец трубки, стараясь не повредить трубку.

Убедитесь, что осталось достаточно свободного пространства для закрытия трубки. Сложите оставшийся открытый конец трубки дважды, затем зафиксируйте его зажимом и обмотайте зажим резинкой. Далее, с помощью другой резинки прикрепите стеклянный флакон с воздухом к зажиму на одном конце диализационной трубки.

Затем прикрепите к другому зажиму флакон с песком. Эти флаконы гарантируют, что трубки будут оставаться погруженными в диализат. Теперь поместите всю систему трубок в резервуар для диализа, содержащий диализат.

Перемешивайте диализат с помощью магнитной мешалки на низкой скорости при комнатной температуре. Следите за тем, чтобы скорость перемешивания оставалась низкой и раствор не подвергался вортексерированию. Замените диализат трижды в течение одного дня.

В данном видео диализат заменяют через 2,5, 6,5 и 11,5 часов. Продолжайте диализ в течение ночи, чтобы общее время составило от 20 до 28 часов. По завершении диализа извлеките трубку из диализата и осторожно откройте один зажим, чтобы извлечь образец.

Трижды промойте диализную трубку водой и объедините промывные воды с образцом. В завершение удалите воду из образца при пониженном давлении. Это осуществляется путем лиофилизации.

Образец замораживают, затем помещают в аппарат для лиофилизации. Чтобы оценить наличие свободного металла в образце, сначала приготовьте ацетатный буфер, растворив 1,4 мл уксусной кислоты в 400 мл воды, доведите pH до 5,8 с помощью одного молярного раствора гидроксида аммония и добавьте воду до достижения общего объема 500 мл. Затем растворите 0,3 мг каждого комплекса в 0,3 мл буфера.

Теперь приготовьте индикатор xol orange, концентрация которого должна составлять 16 µM в буферном растворе с pH 5,8. Добавьте три миллилитра этого раствора индикатора к предварительно растворенным комплексам металлов. Определите наличие свободного металла по изменению цвета индикатора с желтого на фиолетовый.

При необходимости количество свободного металла можно определить количественно путем построения калибровочной кривой. Если свободный металл присутствует, образец следует подвергнуть дополнительной очистке с помощью диализа или высокоэффективной жидкостной хроматографии перед проведением характеризации. Затем, чтобы определить координационное число воды для образца опиума, приготовьте раствор комплекса, содержащего опиум, в воде с концентрацией около 1 мМ, а также другой раствор той же концентрации в оксиде дейтерия.

Перед началом анализа раствор оксида дейтерия необходимо трижды выпарить и снова растворить в оксиде дейтерия для удаления остатков воды. Включите спектрофлуориметр, перенесите водный раствор в чистую кювету и поместите кювету в спектрофлуориметр. Выполните сканирование возбуждения и эмиссии, чтобы определить максимумы, которые составляют приблизительно 395 nanometers и 595 nanometers соответственно. Затем проведите эксперимент по определению времени затухания фосфоресценции, используя только что определенные длины волн возбуждения и эмиссии, а также параметры, представленные здесь.

Повторите этот шаг с подготовленным раствором оксида дейтерия; на основе полученных данных о затухании люминесценции постройте график зависимости натурального логарифма интенсивности от времени. Наклон этих линий соответствует скоростям затухания. В данном видео для построения графиков натурального логарифма на основе исходных данных использовался Microsoft Excel 2007.

Используйте константы скорости распада в уравнении, разработанном Хорсом и коллегами, представленном здесь. Если ваш лиганд содержит OH- или NH-группы, координированные с металлом, уравнение необходимо модифицировать перед использованием. Чтобы определить относительные показатели образца, сначала выберите на анализаторе времени релаксации нужный режим применения: T1 или T2.

Здесь выбирается настройка T1. Затем подготовьте серию образцов, содержащих различные концентрации комплекса с лантаноидом в водном растворителе. В качестве растворителя используется вода, а концентрации растворов составляют 10, 5, 2, 0,5, 1,25, 0,625 и 0.

Приготавливают миллимолярные растворы. Можно использовать другие подходящие растворители или буферы, но важно использовать данный растворитель в качестве холостой пробы. Конечный объем образца зависит от используемого прибора.

Поместите образец в прибор и выдержите его в течение пяти минут для уравновешивания по температуре прибора, которая для устройства, используемого в данном видео, составляет 37 °C. Теперь определите время релаксации в секундах, настраивая параметры программного обеспечения для получения гладкой экспоненциальной кривой для T1 или T2. Повторите эту процедуру для всех образцов, включая холостую пробу.

Теперь рассчитайте обратные значения измеренных времен релаксации T1 или T2 и постройте график. Постройте зависимость этих значений от концентрации лантанида в миллимолярных единицах и аппроксимируйте график прямой линией. Наклон полученной прямой соответствует релаксивной активности R1 или R2 для T1 и T2 соответственно.

Здесь представлена общая схема метилирования и очистки. Данная схема иллюстрирует общий порядок проведения метилирования и причины выбора различных путей очистки. Здесь приведен репрезентативный график затухания люминесценции, на котором натуральный логарифм затухания отложен в зависимости от времени; наклоны прямых, полученных из аналогичных кривых для растворов в воде и оксиде дейтерия, используются в уравнении 1 для определения координационного числа молекул воды в комплексах, содержащих тербий.

Репрезентативный пример измерения ливити приведён здесь, где наклон аппроксимирующей прямой соответствует ливити T₁ образца. Помимо определения координационного числа воды и характеристики ливити, описанных в протоколе, важно также охарактеризовать конечные продукты с помощью стандартных химических методов. Идентификация соединения может быть осуществлена с помощью масс-спектрометрии; здесь представлены репрезентативные масс-спектры, демонстрирующие диагностические изотопные паттерны для комплексов, содержащих гадолиний и опиум.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как ЭПР-спектроскопия, ВЭЖХ и элементный анализ, для дальнейшей характеристики полученных комплексов. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как синтезировать, очищать и характеризовать лантаноидсодержащие комплексы, которые могут быть использованы для маркировки биологических макромолекул.