Идентификация и характеристика гликозилирования белков с использованием конкретных эндо-и exoglycosidases

Общая цель данного эксперимента — продемонстрировать использование гликозата для ферментативного дегликозилирования и анализа N- и O-гликозилирования на модельном гликопротеине. Это достигается путем обработки гликопротеина PGA's F или смесью для дегликозилирования белков. Кроме того, смесь для дегликозилирования белков была дополнена смесью дополнительных экзогликозидаз, которые иногда помогают удалить устойчивые к расщеплению сахара.

Мы демонстрируем этот метод на примере модельного гликопротеина — рекомбинантного бета-субъединицы хорионического гонадотропина человека, или HCG beta. Затем проводится электрофорез в ПААГ с SDS, после чего следует окрашивание кумасси синим и метод специфического окрашивания сахаров Pro Q Emerald 300 для анализа O-гликозилирования. Результаты анализа образцов HCG beta показывают, что HCG beta гетерогенно гликозилирован и содержит несколько гликоформ, что подтверждается различиями в миграции белка с обработкой гликозидазой и без неё, а также ослаблением сигнала при окрашивании Pro Q по мере последовательного удаления гликанов.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как масс-спектрометрический анализ, является его простота, использование стандартного лабораторного оборудования и доступность для начинающих специалистов в области гликобиологии. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области гликобиологии, например, гликозилирован ли данный белок. Для начала ферментативного дегликозилирования разморозьте буферы из набора для дегликозилирования белков.

Тщательно перемешайте содержимое пробирок и выдержите при комнатной температуре. Поместите флаконы с ферментом на лед, растворите содержимое флакона с HCG бета в 600 µL дистиллированной воды и держите на льду. Приготовив 1 mL 1X буфера XG семь путем разведения 10x стокового раствора в дистиллированной воде, используйте 25 µL этого раствора для разведения 0.5 µL PGA's f.

Приготовьте смесь экзогликозидаз, объединив по два микролитра каждого из четырех экзогликозидаз. Затем добавьте HCG beta и 10-кратный денатурирующий буфер для гликопротеинов в семь пронумерованных ПЦР-пробирки, как указано в письменном протоколе, закройте пробирки крышками и осторожно перемешайте. Денатурируйте белки в термоциклере путем инкубации в течение 10 минут при 94 °C, после чего установите режим Hold при 4 °C. После извлечения пробирок из термоциклера центрифугируйте их, чтобы удалить видимый конденсат. В каждую реакционную пробирку добавьте оставшиеся реагенты согласно письменному протоколу. Закройте ПЦР-пробирки новыми крышками.

Затем перемешайте содержимое пробирок, осторожно постучав по ним четыре раза после центрифугирования, поместите пробирки в термоциклер и инкубируйте при 37 °C в течение четырех часов. После этого охладите образцы до 4 °C. Для проведения SDS-PAGE приготовьте свежий 3x восстанавливающий буфер для нанесения образцов SDS.

Добавьте 12,5 мкл приготовленного трехкратного восстанавливающего буфера для нанесения SDS к каждому образцу с DTT, закройте пробирки новыми крышками и осторожно постучите по ним для перемешивания. Инкубируйте пробирки в термоциклере при 94 °C в течение пяти минут, затем охладите до 4 °C. После инкубации нанесите 30 мкл каждого образца и 10 мкл белкового маркера на 10–20% трицин-глициновый гель, сохранив остатки каждого образца.

Проведите электрофорез геля при 130 В до тех пор, пока фронт окрашивания не достигнет нижней части геля. По завершении электрофореза извлеките гель из формы и поместите его в небольшой пластиковый контейнер с достаточным количеством красителя кумасси синий, чтобы полностью покрыть гель. Окрашивайте гель в течение одного часа при осторожном перемешивании.

Промойте трижды по 30 минут. В 50 миллилитрах раствора для дестайнинга зарегистрируйте изображения с помощью трансиллюминатора белого света или сканера. В качестве альтернативы гель можно высушить между листами целлофана.

В отдельной раме прогоните остатки каждой пробы и белковый маркер на 10–20% Tri-глициновом геле, пока гель работает. Растворите реагент ProQ emerald в DMF и приготовьте стоковые растворы для фиксации, промывки и окисления для окрашивания, следуя инструкции к набору. По завершении электрофореза извлеките гель из формы и поместите его в пластиковый контейнер.

Зафиксируйте гель, добавив 100 миллилитров приготовленного фиксирующего раствора. Оставьте гель на ночь при комнатной температуре с осторожным перемешиванием на следующий день. Промойте гель 100 миллилитрами приготовленного промывочного раствора в течение 10–20 минут при комнатной температуре с осторожным перемешиванием, повторив промывку второй раз со свежим промывочным раствором.

Затем окислите углеводы, инкубируя гель при осторожном перемешивании в течение 30 минут в 25 миллилитрах приготовленного окисляющего раствора; после инкубации промойте гель еще дважды. Приготовьте свежий краситель ProQ Emerald 300, добавив 500 мкл раствора реагента ProQ Emerald 300 к 25 миллилитрам буфера для окрашивания, входящего в состав набора. Окрасьте гель, инкубируя его в приготовленном красителе в темном месте при осторожном перемешивании от 90 до 120 минут.

Повторите два этапа промывки, описанных ранее. Затем зарегистрируйте изображения с помощью УФ-трансиллюминатора при 300 нанометрах. В качестве заключительного этапа сравните изображения геля, окрашенного кумаси, с изображениями геля, окрашенного ProQ emerald.

Изменения в миграции белка после ферментативной дегликозилизации становятся заметны при сравнении контрольного образца с образцом, подвергнутым воздействию PGA's F. Для удаления N-гликанов используется смесь для дегликозилирования; при применении этой смеси для удаления N- и O-гликанов дальнейшего уменьшения размера после переваривания дополнительной гликозатой не наблюдается. Помимо изменения массы, при удалении гликанов полосы становятся более четкими.

Полоса, расположенная ниже маркера 17 килodalton, вероятно, представляет собой полностью дегликозилированный бета-полипептид ХГЧ. Дорожки с пятой по седьмую демонстрируют полосы, соответствующие Glyco. Другие полосы могут быть результатом неполного дегликозилирования или присутствия нескольких неидентифицированных белков в образце бета-ХГЧ.

Реагент «изумрудный зеленый» окисляет и окрашивает все гликаны, присутствующие в молекуле белка. Таким образом, интенсивность сигнала снижается по мере ферментативного дегликозилирования бета-субъединицы ХГЧ. Остаточный сигнал в дорожках три и четыре указывает на наличие гликановых мотивов, устойчивых к используемым ферментам.

В четвертой дорожке используется дополнительный гликозат. Удалите несколько лишних остатков сахаров. Миграция белка остается прежней, однако наблюдается небольшое снижение интенсивности окрашивания.

Резистентные сахарные остатки присутствовали не во всех видах белков. Некоторые полосы не были обнаружены с помощью emerald Green, что указывает на их глубокое дегликозилирование. Дополнительные данные подтверждают вывод о том, что HCG beta гликозилирована гетерогенно. Нижняя полоса в дорожке два слабо видна на изображении emerald green.

Хотя верхняя полоса во второй дорожке яркая, что указывает на сохранение многих гликановых групп, эти данные подтверждают вывод о том, что рекомбинантный HCG beta, экспрессированный в клетках мыши, содержит множество гликоформ из-за присущей гликозилированию гетерогенности. После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как масс-спектрометрия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например: какова степень заполнения? Какова степень гликозилирования или какова тонкая структура гликанов?

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как использовать glycosylate для ферментативного дегликозилирования и анализа N-гликанов, связанных с NNO. При работе с гликопротеинами выбор метода детекции может быть затруднен, поскольку окрашивание белков оказывается полезным только в том случае, если дегликозилирование приводит к значительному сдвигу молекулярной массы других белков.

Мы наблюдали аномальную миграцию после дегликозилирования и установили, что любое изменение миграции свидетельствует о том, что белок был дегликозилирован.