Гальванотаксис пробирного анализа нейронных клеток-предшественников Кинетика миграции извне постоянного тока электрическое поле

Общая цель данной процедуры заключается в визуализации миграции нейральных клеток-предшественников, полученных из тканей взрослого организма, в условиях воздействия электрического поля постоянного тока. Для этого сначала проводят выделение и культивирование субэпендимальных нейральных клеток-предшественников из мозга взрослой мыши. Следующим этапом является подготовка камер Galvan Axxis и перенос нейральных клеток-предшественников в эти камеры.

Заключительным этапом является приложение электрического поля постоянного тока к камере Galvan Axxis и проведение таймлапс-визуализации для наблюдения за миграцией нейропрекурсоров. В итоге с помощью таймлапс-микроскопии регистрируются гальванотаксические свойства нейропрекурсоров в их дифференцированном и недифференцированном состояниях. Хотя данный метод позволяет изучить гальванотаксис нейропрекурсорных клеток, его также можно применять к другим системам, например, к модели инсульта у мышей для изучения привлечения нейропрекурсоров в места повреждения с целью усиления нейронного восстановления.

Процедуру продемонстрирует Роб Пилли Пост, аспирант моей лаборатории. Перед началом данной процедуры NPC должны находиться в культуре в течение семи дней, чтобы свободно плавающие первичные нейросферы были готовы к сбору. При необходимости начните подготовку трех камер Galvan Axxis, поместив в них три квадратных стекла.

Во-первых, поместите покровные стекла в флакон с 6 N соляной кислотой на ночь. Рано на следующий день начните медленное размораживание Matrigel на льду. Через четыре часа гель будет готов для создания камеры.

Сначала с помощью стеклореза с алмазным наконечником вырежьте шесть прямоугольных полосок стекла из новых квадратных предметных стекол. Затем перенесите промытые кислотой квадратные и прямоугольные стекла в ламинарный бокс.

Промойте стеклянные полоски 70% ethanol, затем водой для культур тканей, прошедшей автоклавирование. Дайте им высохнуть на воздухе или просушите их на безворсовой бумаге. Затем нанесите вакуумную смазку по периметру одной поверхности каждого квадратного предметного стекла и загерметизируйте их на основании пластика размером 60 миллиметров.

Чашки Петри. Нанесите вакуумную смазку на одну сторону прямоугольных стеклянных полосок и приклейте их к противоположным краям предметных стекол, чтобы создать квадраты с центральным желобком в центре каждой чашки.

Стерилизуйте эти модифицированные стеклянные квадраты или камеры ультрафиолетом в вытяжном шкафу в течение не менее 15 минут. Затем нанесите пипеткой от 250 до 300 µL полилизина в центральный желоб камер. После этого инкубируйте камеры при комнатной температуре в течение двух часов, завершив процедуру примерно за 15 минут до окончания инкубации.

Спустя два часа приготовьте раствор Matrigel, аспирируйте поли-L-лизин и промойте центральные желобки 1 мл автоклавированной воды. Затем дозированно внесите от 250 до 300 µL раствора Matrigel в центральные желобки и инкубируйте камеры при 37 °C в течение одного часа. После инкубации аспирируйте раствор Matrigel.

Затем осторожно промойте центральные желобки одним или двумя миллилитрами SFM. Теперь пипеткой нанесите 100 µl E-F-H-S-F-M или F-B-S-S-F-M в центральные желобки для подготовки к посеву культивируемых клеток. Затем перенесите пипеткой четыре или пять миллилитров культуры, содержащей нейросферы, в новую чашку Петри диаметром 60 мм.

Затем поместите чашку Петри на предметный столик счетного микроскопа под пятикратным окуляром. С помощью дозатора P 10 осторожно перенесите от пяти до восьми целых нейросфер в центральный желоб каждой камеры. До четырех.

Нейросферы можно перенести сразу, но не допускайте их смешивания с нейросферами в центральных желобках. Осторожно распределите их, не повреждая подложку из матригеля. Затем добавьте дополнительные 150 microliters E-F-H-S-F-M или F-B-S-S-F-M в центральные желобки.

Теперь культивируйте клетки в увлажненном инкубаторе. Через 17–20 часов культивирования будут получены недифференцированные NPCs, а через 69–72 часа культивирования — дифференцированные NPCs.

Под считающим микроскопом выберите камеру с наиболее подходящими клетками для анализа миграции живых клеток. Клетки должны быть округлыми, почти полностью отделенными от своих нейросфер и еще не успевшими или только начавшими формировать отростки в стерильном боксе. Подготовьте покровное стекло для камеры.

Промойте квадратный стеклянный покровный стеклянный предметный предмет 70% ethanol, затем автоклавированной водой и нанесите полоску вакуумной смазки на два параллельных края. Теперь накройте камеру. Сначала аспирируйте культуральную среду из центрального желоба, а затем быстро закройте камеру, установив покровное стекло на прямоугольные стенки по типу крыши.

Затем с помощью капиллярного эффекта внесите 100 µL свежей среды в центральный желоб. Теперь используйте вакуумную смазку, чтобы создать границы для резервуаров с культуральной средой. С каждой стороны центрального желоба в системе визуализации живых клеток подготовьте пробирки с агарозным гелем, электроды из серебра и хлорида серебра, а также две чашки Петри диаметром 60 мм.

Используя камеры в качестве резервуаров с культуральной средой, оставьте их в среде при 37 °C и 5% carbon dioxide на 20–30 минут. В течение этого времени подготовьте крышки двух пустых чашек Петри и крышку чашки Петри с камерами Galvan Axxis, просверлив в них отверстия с помощью инструмента Dremel или пипетки; нанесите от 1,5 до 2 мл среды по обе стороны от центрального желоба и добавьте от 7 до 8 мл SFM в каждую пустую чашку Петри. Поместите по одной чашке Петри с каждой стороны центрального желоба камеры и поместите по одному электроду в каждую чашку.

Соедините камеру с чашками Петри с помощью гелевых мостиков для обеспечения электрической непрерывности. Используя гелевые мостики Agros, подключите электроды к внешнему источнику питания, последовательно соединив его с M-метром для измерения силы электрического тока, и включите источник питания. Используйте вольтметр для измерения напряженности электрического поля непосредственно в центральном желобе.

Отрегулируйте выходное напряжение блока питания при необходимости. Теперь запустите модуль таймлапс-съемки в системе визуализации. В программном обеспечении Axio vision выберите «многомерный сбор данных» (multidimensional acquisition) и нажмите «ОК».

Для каналов выберите шестой канал, нажмите T для таймлапса. В настройках интервала таймлапса установите значение одна минута, установите продолжительность восемь часов в полях «до» (before) и «после» (after) временной точки, выберите временные точки «до» и «после». Теперь нажмите «старт» и дайте эксперименту пройти в течение необходимого времени; после завершения анализа переходите к иммуногистохимическому (ИГХ) анализу.

Кинематический анализ показал, что при воздействии постоянного электрического поля (DCEF) напряженностью 250 мВ/мм недифференцированные НПК демонстрируют высоконаправленный и быстрый гальванотаксис в сторону катода; при данной напряженности более 98% недифференцированных НПК мигрировали на протяжении всех шести-восьми часов визуализации. В отсутствие DCEF наблюдалось случайное движение клеток.

Поскольку мертвые клетки не мигрируют, это позволяет предположить, что в течение данного периода они остаются жизнеспособными. В отсутствие или при наличии A-D-C-E-F дифференцированные фенотипы демонстрировали незначительную миграцию как в присутствии, так и в отсутствие подмножеств дифференцированных клеток A-D-C-E-F. Наблюдались вытянутые отростки, которые стремились ориентироваться перпендикулярно направлению DCEF, однако заметного перемещения тел клеток обнаружено не было.

Иммуноокрашивание подтвердило, что NPC сохраняли положительную экспрессию маркера нейральных предшественников nest in после шести часов воздействия DC EF. В анализах с использованием NPC, индуцированных к дифференцировке в зрелые фенотипы, большинство клеток экспрессировали маркер зрелых астроцитов глиальный фибриллярный кислый белок или GFAP после шести часов воздействия DCEF. После проведения данной процедуры можно получить представление о клеточных механизмах, участвующих в преобразовании электрического поля постоянного тока в подвижность клеток, используя модели генетического нокаута.

Или, сэр, например.