Анализ нейронной миграции Крест и дифференциация по межвидовой трансплантации
7 февраля 2012 г.
Подход к анализу миграции и в конечном итоге судьба птичьего клеток нервного гребня в перепелиных-химерных эмбрионов куриных описано. Этот метод является простым и техника для отслеживания клеток нервного гребня во время миграции и дифференциации, которые иначе трудно различить в unmanipulated куриного эмбриона.
Общая цель данной процедуры заключается в пересадке экспланта дорсальной части нервной трубки эмбриона перепела в соответствующий по стадии развития эмбрион курицы для отслеживания миграции и дальнейшей судьбы клеток нервного гребня. Для этого сначала в мембране IGN эмбриона-хозяина (курицы) делают небольшое отверстие для доступа к нервной трубке. Затем эмбрион-донор (перепел) извлекают из яйца для подготовки к эксцизии трансплантата.
На следующем этапе из нейральной трубки эмбриона-реципиента вырезают интересующий участок. Затем аналогичный участок вырезают из нейральной трубки донора для последующей трансплантации. После этого фрагмент нейральной трубки донора пересаживают в нейральную трубку реципиента.
Наконец, химерный эмбрион инкубируют до нужной стадии для обнаружения клеток нейрального гребня, достигших выбранного органа. В конечном итоге миграцию и дифференцировку производных от донора клеток нейрального гребня в различных областях эмбриона-хозяина можно визуализировать с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, поскольку этапы микродиссекции и трансплантации требуют очень тонкой моторики, что затрудняет их освоение.
Начните с промывания куриных яиц теплой водой для удаления загрязнений. Разложите яйца горизонтально на лотке, затем отметьте карандашом верхнюю сторону, чтобы обозначить область локализации эмбриона. Для подготовки донорских эмбрионов методом X ovo инкубируйте перепелиные яйца тупым концом вниз.
Далее поместите яйца в увлажненный инкубатор при температуре 38 °C и включите функцию покачивания. После завершения инкубации стерилизуйте верхнюю часть яиц, распылив 70% ethanol, а затем быстро протрите их салфеткой Kimwipe. Чтобы избежать впитывания раствора через скорлупу, поместите каждое стерилизованное яйцо в отдельный держатель, подобный чашке Петри, выложенной сложенными салфетками Kimwipe, как показано здесь. Затем с помощью стерильного пинцета AA проделайте небольшое отверстие в верхней части скорлупы со стороны острого конца яйца.
Оснастите шприц объемом 5 мл гиподермической иглой калибра 18,5. Затем, направив срез иглы к остроконечному концу яйца, введите иглу вертикально в отверстие в яичной скорлупе. Чтобы избежать случайного повреждения желтка при всасывании, предварительно очистите отверстие 70% ethanol и заклейте его клейкой лентой.
Затем с помощью зажима double A проделайте еще одно отверстие на отмеченной верхней поверхности горизонтальной ножки, немного не доходя до вершины. Далее введите один конец изогнутого ирисного пинцета в отверстие параллельно яйцу. Затем зажмите скорлупу, совершая круговые движения.
В курином яйце сделайте окно диаметром 2 см; удаленный фрагмент скорлупы выбросьте. Эмбрион должен выглядеть как непрозрачный диск на поверхности желтка. Отбракуйте все неоплодотворенные яйца, которые определяются по наличию небольшого белого пятна на поверхности желтка или отсутствию бластодермы.
Теперь, используя соответствующие средства защиты глаз, согните гиподермическую иглу калибра 26,5 под углом 45 градусов, начиная от основания иглы. После прикрепления согнутой иглы срезом вверх к шприцу объемом 1 мл заполните иглу разбавленными индийскими чернилами. Проколите желточную мембрану за пределами периметра бластера и просуньте кончик иглы под эмбрион, близко к поверхности желтка, но не заходя в эмбриональные слои.
Затем введите достаточное количество чернил, чтобы обвести контур эмбриона, стараясь не допустить попадания пузырьков воздуха. Осторожно извлеките иглу. Теперь используйте стереомикроскоп и источник света с низким тепловым воздействием, такой как показанная здесь оптоволоконная лампа на гибком штативе.
Определите стадию развития эмбрионов в соответствии с классификацией Hamburger и Hamilton. Отметьте стадию на яичной скорлупе. Затем нанесите две-три капли теплого стерильного раствора Рингера на поверхность эмбрионов, чтобы предотвратить обезвоживание и контаминацию.
Затем накройте поверхность яиц парафильмом, чтобы временно герметизировать окна. Далее подготовьте перепелиные яйца к пересадке. Перед извлечением яиц из инкубатора наполните чашку Петри раствором Рингера.
Затем вскройте яйца с тупого конца с помощью изогнутого пинцета, чтобы обнажить эмбрион. С помощью диссекционных ножниц сделайте четыре разреза в форме квадрата через виллиозную мембрану и бластердерму вокруг эмбриона, убедившись, что все разрезы соединяются между собой. Затем, используя изогнутый ирисовый пинцет, осторожно захватите один из краев разреза, поднимите эмбрион из яйца и перенесите его в подготовленную чашку Петри.
Наконец, осторожно удалите вителлиновую мембрану с помощью пинцета №5, после чего определите стадию развития эмбрионов подt диссекционным микроскопом. Снимите парафильм с эмбриона цыпленка-хозяина. Затем, используя заточенную вольфрамовую иглу, сделайте небольшое отверстие в VII мембране в выбранной области нейральной трубки.
Добавьте каплю раствора Рингера к эмбриону. Затем, для односторонних трансплантатов, как в данном видео, используйте стеклянную иглу с загнутым концом, чтобы осторожно сделать поперечные ростральный и каудальный разрезы в области среднего мозга нейральной трубки, не заходя за пределы просвета. После этого выполните двусторонний разрез между дорсальной частью нейральной трубки и париетальной мезодермой.
Наконец, аккуратно отделите иссеченный эксплантат X от нейральной трубки, а затем извлеките его из эмбриона, аспирировав в стеклянную микропипетку. Сначала используйте эмбрион перепела соответствующей стадии развития. Затем иссеките участок нейральной трубки аналогичного размера, как было показано ранее, и аспирируйте донорский эксплантат X в стеклянную микропипетку, содержащую раствор Рингера.
Перенесите эксплантат X рядом с иссеченным участком цыпленка-хозяина. Затем, используя вытянутую стеклянную иглу, аккуратно направьте эксплантат в область абляции. Осторожно добавьте несколько капель раствора Рингера на эмбрион, чтобы предотвратить обезвоживание.
Наконец, загерметизируйте окно упаковочной лентой, убедившись, что лента полностью закрывает область окна в яйце, и верните яйцо в инкубатор до достижения нужной стадии; при инкубации химеры функцию раскачивания следует отключить, при этом яйца можно аккуратно поворачивать вручную дважды в день для повышения их жизнеспособности. Если целью являются более поздние стадии развития, то на данном репрезентативном изображении области трансплантата в нервной трубке после шести часов повторной инкубации до стадии HH 11 показана ожидаемая интеграция донорской ткани перепела в нервную трубку куриного эмбриона-реципиента. Данный поперечный срез через область трансплантата на стадии HH 11 демонстрирует клетки нервного гребня, маркированные hnk, одна из которых мигрирует латерально от нервной трубки.
Клетки перепела, участвующие в миграционном потоке клеток нервного гребня и в формировании нервной трубки, четко маркированы с помощью QCPN. На более поздних стадиях можно проследить путь клеток, произошедших из клеток нервного гребня перепела, до их конечной ткани-мишени. Как видно на этом рисунке, клетки, маркированные QCPN, перемежаются в мезенхиме верхнечелюстного отростка эмбриона цыпленка. На стадии E5 антитела QCPN можно легко комбинировать с другими антителами для изучения дифференцировки клеток нервного гребня, полученных от перепела.
В среде хозяина. Как видно здесь, сенсорные нейроны тройничного нерва, производные от клеток нервного гребня перепела, помечены антителами QCPN и T UJ one. После этой процедуры можно применить другие методы, такие как иммуногистохимия и гибридизация in situ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, в какие ткани дифференцируются клетки нервного гребня и какие гены экспрессируют клетки нервного гребня в процессе их дифференцировки в различные ткани.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается метод анализа миграции и дальнейшей судьбы клеток нервного гребня птиц в химерных эмбрионах перепела и курицы. Этот метод позволяет отслеживать данные клетки в процессе их миграции и дифференцировки, что затруднительно реализовать в неманипулированных эмбрионах курицы.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биология развития
- Эмбриология
Теоретическая часть
- Клетки нервного гребня имеют решающее значение для развития различных структур у позвоночных.
- Отслеживание их миграции помогает понять их роль в эмбриональном развитии.
- Химерные эмбрионы представляют собой уникальную модель для изучения судьбы клеток.
- Традиционные методы могут быть недостаточно эффективны для дифференциации этих клеток.
Цель исследования
- Разработка простого метода отслеживания клеток нервного гребня.
- Анализ паттернов миграции этих клеток в контролируемой среде.
- Углубление понимания процессов дифференцировки клеток нервного гребня.
Используемые методы
- Трансплантация экспланта дорсальной части нейральной трубки эмбриона перепела в эмбрион курицы.
- Создание небольшого отверстия в мембране IGN эмбриона-реципиента для обеспечения доступа.
- Иссечение интересующих областей из эмбрионов как реципиента, так и донора.
- Пересадка нейральной трубки донора в нейральную трубку реципиента.
Основные результаты
- Данный метод позволяет успешно проследить миграцию клеток нервного гребня.
- Химерные эмбрионы демонстрируют четкие паттерны дифференцировки.
- Результаты указывают на применимость данной методики для будущих исследований.
- Потенциальные возможности применения для изучения нарушений развития.
Выводы
- Данный метод представляет собой надежный способ изучения динамики клеток нервного гребня.
- Он открывает новые возможности для дальнейших исследований в области биологии развития.
- Будущие исследования могут опираться на этот метод для изучения родственных явлений.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Межвидовая трансплантация нервной трубки в зародыши птиц позволяет осуществлять точное отслеживание линий и картирование судьбы клеток нервного гребня, что способствует механистическому снижению рисков на ранних этапах поиска. Данный подход обеспечивает детальное понимание процессов миграции, дифференцировки и предварительного паттернирования клеток, что служит основой для валидации мишеней и разработки стратегий моделирования заболеваний. Адаптивность метода и возможность получения количественных данных делают его универсальной платформой для использования в биологии развития и в рамках трансляционных исследовательских программ.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет проверять гипотезы развития путем отслеживания миграции и судьбы клеток нервного гребня.
- Способствует биологическому снижению рисков за счет прямой визуализации клеточного происхождения и результатов дифференцировки.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней, выявляя регион-специфический пре-паттернинг и влияние окружающей среды.
- Повышает прогностическую уверенность при сортировке портфеля проектов за счет выяснения механизмов развития.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные химерные системы для последующего фенотипического скрининга и исследований возмущений.
- Стандартизирует анализы картирования судьбы клеток с использованием видоспецифического маркирования и воспроизводимых протоколов трансплантации.
- Обеспечивает количественную оценку конечных точек миграции и дифференцировки с помощью иммунофлуоресценции и антительных маркеров.
- Поддерживает масштабируемую адаптацию для скрининга химических соединений или генетических возмущений в контексте развития.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует принципам моделирования релевантных заболеваний, позволяя манипулировать окружением клеток нервного гребня и их генетическим фоном.
- Обеспечивает непрерывность процесса от открытия до доклинической валидации благодаря результатам картирования судьбы клеток и отслеживания клеточных линий.
- Снижает риски при трансляционном продвижении за счет уточнения вклада различных типов клеток в органогенез и паттернирование.
- Способствует идентификации биомаркеров путем сочетания отслеживания клеток с иммуногистохимией и анализом экспрессии генов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод трансплантации и отслеживания охватывает весь цикл от ранних этапов поиска до доклинических исследований, обеспечивая проверку гипотез, снижение рисков при изучении механизмов и преемственность трансляционных исследований.
- Фундаментальная биология: позволяет проводить проверку гипотез о происхождении, миграции и судьбе клеток нервного гребня в контролируемой системе.
- Скрининг: предоставляет стандартизированные, воспроизводимые химерные модели для оценки генетических или молекулярных нарушений.
- Аналитика: обеспечивает количественные показатели с помощью иммунофлуоресценции и идентификации клеток на основе антител.
- Трансляционные исследования: связывают отслеживание линий развития с моделированием заболеваний и поиском биомаркеров.
- Применение в масштабе предприятия: предлагает гибкую и экономически эффективную платформу, адаптируемую к различным видам и экспериментальным задачам.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации целей развития.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые и масштабируемые рабочие процессы трансплантации и трейсинга.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет раннего выяснения механизмов развития.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию и продвижение релевантных моделей и целей заболеваний с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в методах эмбриональной микродиссекции и трансплантации.
- Необходим доступ к оборудованию для стереомикроскопии, иммунофлуоресценции и мечения антителами.
- Требуется строгая стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
- Метод может быть адаптирован для использования на моделях птиц и некоторых млекопитающих для расширения области применения.
- Ограничения связаны с требованиями к техническим навыкам и видовой совместимостью при создании химерных трансплантатов.
