Анализ и построение структуры нуклеиновых кислот с 3DNA

Общая цель данной процедуры — предоставить лабораторным исследователям и другим специалистам пакет программ 3D NA для изучения пространственной организации ДНК и РНК с помощью современных вычислительных инструментов. Это достигается путем первоначального скачивания программного обеспечения с форума 3D NA и его установки на локальный компьютер. Вторым этапом является анализ репрезентативной структуры ДНК на уровне составляющих её ступеней базовых пар.

Затем та же структура ДНК модифицируется на уровне шага пары оснований, после чего восстанавливается с использованием вновь определенных параметров шага пары оснований. Следующим этапом является анализ большого ансамбля родственных структур. Заключительным этапом является совмещение набора родственных структур ДНК по общей системе координат для визуализации глобальных искажений структур.

В конечном счете, инструменты 3D NA используются для изучения того, как отдельные шаги пар оснований, включая те, что связаны с лекарственными препаратами и белками, влияют на общую укладку ДНК, а также для определения мест и направлений значительных глобальных искажений. Основным преимуществом данного метода перед существующими подходами является надежность программного обеспечения и возможность его широкого применения к различным структурам, содержащим нуклеиновые кислоты. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биохимии и биофизики, такие как организация геномов в трехмерном пространстве и типы деформаций, которые может принимать ДНК.

Для начала установки пакета программного обеспечения перейдите на веб-сайт three DA @xthreed. org и нажмите на ссылку на форум 3D NA. На форуме выберите ссылку «регистрация» и следуйте инструкциям по созданию новой учетной записи.

После создания имени пользователя и пароля войдите на форум, перейдите по ссылке «downloads» (загрузки) в разделе приветствия и на открывшейся странице выберите «3D NA download». Дважды щелкните по файлу tar gz, чтобы создать папку с названием X 3D NA dash V 2.1, в которой содержится программное обеспечение 3D NA. Откройте приложение «Терминал» (обычно находится в разделе «Утилиты» на Macintosh) и перейдите в каталог X 3D NA dash V 2.1.

Запустите скрипт настройки, необходимый для правильного функционирования 3D NA. Все команды, используемые в данном видео, приведены в текстовом протоколе. Затем скопируйте двухстрочные настройки экспорта, отображенные на экране.

Если пользователь разместил программное обеспечение в директории приложений, две строки должны выглядеть так, как показано здесь. Откройте текстовый редактор, находящийся в директории приложений. В меню «Формат» выберите «Сделать простым текстом».

Если файл .bashrc существует, откройте его в текстовом редакторе, отредактируйте и вставьте настройки экспорта в конец файла. Если файла .bashrc нет, вставьте настройки экспорта в пустой файл и сохраните его под именем .bashrc в домашнем каталоге. Чтобы новые настройки вступили в силу, запустите только что сохраненный файл .bashrc в терминале.

В данном видео демонстрируется анализ репрезентативной структуры нуклеиновой кислоты — ДНК, связанной с белком HBB бактерии Borrelia bergdorfii. Первым этапом 3D-анализа нуклеиновых кислот является создание файла со списком всех спаренных оснований. Для этого вводится команда для применения программы Find para к атомной структуре, сохраненной в файле NP2MP2.pdb.

Следующим этапом анализа является определение геометрических параметров, характеризующих структуру. Команда analyze принимает в качестве входных данных файл с парами оснований и создает несколько выходных файлов, которые появляются в рабочем каталоге. Затем геометрические значения могут быть вычислены путем ввода команды analyze two MP two bps.

Созданные выходные файлы включают два файла: mp2out, содержащий обзор рассчитанных параметров, и bpco_step_par, содержащий список параметров жесткого тела. В дополнение к анализу структуры нуклеиновых кислот программное обеспечение 3D NA предоставляет возможность построить структурную модель на основе параметров жесткого тела с помощью команды rebuild для создания приблизительной атомной модели, включающей координаты как атомов остова, так и атомов оснований. Введите команду, указанную в тексте. Эта команда предписывает 3D NA использовать стандартную конформацию остова B-ДНК при построении моделей из параметров жесткого тела.

После ввода соответствующей команды можно построить модель двойной спирали с параметрами жесткого тела, найденными в структуре H-B-B-D-N-A. Файл параметров шага bpco можно отредактировать для создания модифицированной структуры. В данном случае изменяются экстремальные углы наклона (roll), сформированные в двух точках наибольшего изгиба.

Затем структура создается с использованием модифицированного набора параметров шага в качестве входного файла. Эти две модели можно просматривать с помощью стандартного молекулярного вьюера, в отличие от анализа структуры, содержащей одну нуклеиновую кислоту. В этой части видео будет показано, как анализировать большой ансамбль структур в наборе файлов, имена которых начинаются с MD_set1.pdb и заканчиваются числом.

Первым этапом анализа является идентификация спаренных оснований с помощью программы find pair, как и в предыдущем случае. Поскольку весь набор структур имеет одну и ту же схему спаривания оснований, программу find pair достаточно запустить один раз для репрезентативного файла, в данном случае — файла, заканчивающегося на 1001. Это позволяет сгенерировать информацию о спаривании оснований и сохранить ее в файле MD at set one BPS PS. На следующем этапе определяются геометрические параметры всего набора структур с помощью команды X 3D ncore ensemble.Analyze. После этого необходимые параметры жесткого тела можно извлечь из общего выходного файла MD at set one out.

Данная процедура выполняется с использованием функции извлечения ансамбля трех DCO в Command X. Извлекаются углы крена, после чего создается текстовый файл с этими значениями, разделенными запятыми. Этот файл можно импортировать в другие программы для дальнейшего анализа и построения графиков.

В последней версии 3D NA появилась новая функция, позволяющая пользователю рассматривать несколько структур с единой перспективы. Команда X three DCO ensemble reorient накладывает совокупность родственных структур на общую базовую пару или шаг базовых пар, как и в предыдущих протоколах. Первым шагом является расчет спаривания оснований ДНК с помощью программы find pair.

В данном случае входным файлом являются два PDB-файла KEK: файл, содержащий 10 структур CIA coli, и O 3D NA-оператора, связанного с головной частью белка-репрессора LAC. Команда X three DCO ensemble reorient выровняет отдельные модели в многомодельной структуре относительно общей системы координат. Для выполнения этой команды требуются как PDB-файл, так и файл спаривания оснований, полученный на предыдущем этапе.

Команда также включает идентификатор пары оснований, по которой выравниваются все структуры. Веб-интерфейс W 3D NA содержит некоторые популярные функции программного пакета 3D NA. В этой части видео основное внимание уделяется возможности построения трехмерных моделей ДНК, декорированной белками, с помощью данного веб-сервера.

Первым шагом в создании модели ДНК, декорированной белком, является переход на сайт W 3D NA по адресу W three d.rutgers.edu. Выбор пункта Reconstruction в меню в верхней левой части страницы активирует возможности онлайн-построения моделей. Следующий шаг — переход по ссылке bound protein DNA template, которая находится в светло-затененном поле в центре новой страницы.

Этот выбор активирует выпадающее меню, которое позволяет пользователю указать количество связанных белков. Выбор количества связанных белков ведет на новую страницу спецификации. Затем пользователь может ввести или вставить нужную последовательность.

В текстовом поле в центре новой страницы находится выпадающее меню, с помощью которого можно выбрать спиральную конформацию несвязанных участков ДНК. В нижней части страницы спецификаций расположено текстовое поле для ввода позиций связывания и имен файлов связанных белков. Позиция связывания определяет местоположение центра фрагмента связанного белка в последовательности ДНК.

В нижней части страницы спецификаций находится поле, которое позволяет пользователю создать предварительный просмотр ДНК, связанной с белком. В данном случае это поле отмечено, и нажата кнопка «Продолжить». Это действие формирует страницу просмотра со списком выбранных параметров, а также любыми ошибками, которые могли возникнуть из-за перекрытия выбранных сайтов связывания.

Пользователь может нажать кнопку «Назад», если необходимо внести какие-либо изменения, или кнопку «Собрать» для продолжения. На следующей странице отображается статическое изображение комплекса ДНК-белок в его наиболее растянутой конфигурации, а также доступна интерактивная онлайн-визуализация через веб-интерфейс. Пользователь также может скачать файл с атомными координатами.

Программные средства 3D NA регулярно используются для анализа структур нуклеиновых кислот. Значения параметров жесткого тела выявляют искажения в трехмерной структуре, такие как два участка экстремального изгиба ДНК в сторону большой бороздки с большими положительными углами ролла (roll), обнаруженными на ступенях 13 и 22. В кристаллическом комплексе ДНК с белком RHBB Borrelia Bergdorf.

Возможность программного обеспечения восстанавливать структуры на основе этих величин позволяет определить, какой вклад в общую молекулярную укладку вносят отдельные основания и шаги пар оснований. Как показано здесь, глобальный изгиб ДНК, индуцированный HBB, отражает не только два вышеупомянутых экстремальных искажения ролей. ДНК остается сильно изогнутой даже при реконструкции с выпрямлением этих шагов пар оснований.

Это происходит в тот момент, когда два наибольших значения параметра roll устанавливаются равными нулю. Новые возможности 3D NA по изучению большого количества родственных структур позволяют выявлять паттерны в пространственном расположении моделируемых молекул ДНК и РНК, зависящие как от последовательности, так и от времени. Например, желтая цветовая индикация углов roll между последовательными парами оснований в двух больших наборах моделируемых структур ДНК обнаруживает преимущественный изгиб этих молекул в ступенях пуриновых пар оснований.

Более высокие значения roll, отмеченные красным цветом и сохраняющиеся в течение коротких периодов на концах ДНК, указывают на локальное плавление и повторное формирование структуры двойной спирали. Вариационные закономерности других параметров жесткого тела, таких как углы и расстояния между комплементарными основаниями, могут помочь расшифровать точные структурные искажения. Возможность программного обеспечения 3D NA переориентировать родственные молекулы в общей системе координат выявляет особенности общей структуры, скрытые во многих файлах, хранящихся в Protein Data Bank.

Например, стандартное выравнивание родственных структур на основе среднеквадратичного отклонения соответствующих атомов дает серию схожих пространственных путей, которые здесь примерно накладываются друг на друга; при этом суперпозиция тех же 10 моделей ЯМР оператора O 3D NA Escherichia coli, связанного с головными частями белка-репрессора LAC, в общей системе координат по пятишekkürному терминальному основанию каждой дуплексной цепи выявляет значительные искажения глобальной структуры, при которых молекулы изгибаются в заметно разных направлениях. Структурная вариабельность может влиять на легкость, с которой белок-репрессор LAC Escherichia coli связывается с O 3 и индуцирует петлю между O 3 и последовательно удаленными операторами в опероне LAC. Как показано здесь, точное расположение архитектурного белка, такого как HBB из Borrelia burgdorferi, может оказать драматическое влияние на общую укладку ДНК.

Если две копии известной структуры высокого разрешения разделены 43 парами оснований, фрагмент ДНК длиной 81 пара оснований замыкается в плотную, почти круговую конфигурацию. Если два белка разделены дополнительными пятью парами оснований, ДНК принимает открытую извилистую форму. Столь разные варианты расположения белков на дуплексе демонстрируют, как расстояние между архитектурными белками может влиять на циклизацию или образование петель ДНК после их связывания.

Этот метод открыл исследователям в области структурной биологии нуклеиновых кислот возможность изучать взаимодействия белков с ДНК, РНК, фолдинг и дизайн наночастиц, чтобы лучше понять причины пороков развития и таких заболеваний, как рак, а также разработать новые терапевтические средства.