Высокая пропускная способность последовательного ELISA для проверки биомаркеров острого трансплантат против хозяина

Общая цель следующего эксперимента заключается в использовании высокопроизводительного последовательного анализа ELISA для эффективного анализа большого количества новых биомаркеров, обнаруженных с помощью протеомики. Это достигается путем первоначального добавления образцов в исходный планшет, который используется для создания разведений для каждого биомаркера и хранения восстановленной плазмы между тестами. Затем для каждого белка проводится анализ ELISA с целью определения их концентраций в образцах пациентов.

В конечном итоге можно оценить повышение уровней белков этих биомаркеров при появлении клинических проявлений острой реакции «трансплантат против хозяина». Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими является то, что последовательные анализаторы позволяют анализировать несколько новых белков, которые не всегда доступны на мультиплексных платформах. Применение этого метода перспективно для диагностики острой реакции «трансплантат против хозяина».

Поскольку биомаркеры, валидированные с помощью данного метода, в настоящее время исследуются для применения в клинической практике, данный подход может дать представление об осложнениях после трансплантации поэтических стволовых клеток. Он также может быть применен для поиска и валидации биомаркеров при других заболеваниях, таких как осложнения после трансплантации легких, рак легких или любом другом заболевании, при котором будет полезен диагностический анализ крови.

Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, так как крайне важно последовательно выполнять все этапы для обеспечения воспроизводимости и низкой вариабельности между сериями. За день до начала эксперимента центрифугируйте аликвоты плазмы в течение 10 минут при 15 300 RCF и температуре 4 °C, чтобы отделить сгустки (оседают на дно) и липиды (образуют верхний слой) от плазмы. Затем с помощью ручного пипетирования перенесите по 150 µL неразбавленной плазмы из каждого образца в 96-луночный планшет с V-образным дном согласно заранее определенным схемам. Оберните планшет парафильмом и поместите в камеру для образцов человека при температуре 4 °C на срок до 72 часов.

Затем, после восстановления и разведения антител для захвата IL two receptor alpha и фактора роста эндотелия человека (HGF) в соответствии со спецификациями производителя, внесите аликвоты каждого антитела объемом 50 µL в каждую лунку соответствующих 96-луночных планшетов с высокой сорбционной способностью (half well plates). После этого герметично закройте планшеты с помощью герметика для планшетов и инкубируйте их в течение ночи при температуре 4 °C. Теперь разведите reg three alpha в буфере для покрытия, используя протокол производителя, и внесите 25 µL раствора в каждую лунку 384-луночного планшета no maxor.

Затем в первый день эксперимента также храните этот планшет в герметично закрытом виде при температуре 4 °C. Начните с промывки тестового планшета для рецептора IL-2 alpha и его блокировки раствором Blotto в TBS. После восстановления стандарта подготовьте восьмиточечную калибровочную кривую в соответствии с протоколом производителя.

На следующую планшетку перенесите по 50 µL неразбавленной плазмы и по 50 µL каждого стандарта в двух повторностях из исходного планшета в планшет для ИФА. Затем инкубируйте закрытый планшет при комнатной температуре на ротаторе для планшетов, установленном на 300 RPM. Через два часа извлеките плазму из планшета для ИФА на альфа-цепь интерлейкина-2 рецептора и верните её обратно в исходный планшет с неразбавленной плазмой.

Затем, после завершения ИФА согласно протоколу производителя, измерьте оптическую плотность каждой лунки с помощью планшетного ридера, настроенного на диапазон от 450 до 570 нанометров. Для проведения Reg III$\alpha$ ИФА сначала перенесите 10 µL неразбавленной плазмы в отдельный исходный планшет с V-образным дном, а затем добавьте 90 µL provided буфера для разведения от производителя в каждую лунку для создания исходного планшета с разведением 1:10. После завершения Reg III$\alpha$ ИФА в соответствии с протоколом производителя добавьте стоп-реагент в 384-луночный планшет и измерьте оптическую плотность каждой лунки с помощью планшетного ридера, настроенного на диапазон от 450 до 620 нанометров. После восстановления и разведения захватывающих антител к IL-1 и TNF-R1 согласно спецификациям производителя заполните каждую лунку соответствующих 96-луночных полусферических планшетов с высокой сорбционной способностью 50 µL захватывающих антител.

Затем инкубируйте герметичные тестовые планшеты в течение ночи при комнатной температуре для планшета с elephant и при четырех градусах Цельсия для планшета с TN FFR. После завершения проведения ELISA на IL 2 receptor alpha перенесите 60 µL неразбавленной плазмы в новый исходный планшет. Затем добавьте по 60 µL 1% BSA в PBS в каждую лунку, чтобы создать исходный планшет с плазмой в разведении 1:2.

Затем промойте и заблокируйте планшет для анализа HGF раствором BLOTTO в TBS, после чего подготовьте восьмиточечную кривую разведения стандартов. После промывки планшета и этапа блокировки внесите в лунки планшета для EISA по 50 µL дублирующих аликвот плазмы в разведениях от 1:1 до 1:2, а также каждого стандарта. Затем инкубируйте герметично закрытый планшет в течение ночи при комнатной температуре на ротаторе для планшетов, установленном на 300 RPM.

На следующее утро извлеките разведенную плазму в пропорции 1:2 из планшета для теста HGF ELISA и верните ее в исходный планшет с плазмой, разведенной 1:2. После завершения ИФА в соответствии с протоколом производителя на второй день эксперимента измерьте оптическую плотность каждой лунки с помощью планшетного ридера, настроенного на 450–570 нанометров. Сначала перенесите 10 µL неразведенной плазмы в новый исходный планшет, а затем добавьте 190 µL 1%BSA в PBS, чтобы получить 200 µL плазмы, разведенной 1:20.

Затем, после завершения процедуры ELISA в соответствии с протоколом производителя, Элиза измерила оптическую плотность с помощью планшетного ридера, настроенного на 450–570 нм. Для анализа TN FFR Элиза сначала добавила 25 µL 1% BSA и PBS в исходный планшет с разведением 1:20, в результате чего в каждой лунке получилось 125 µL плазмы в разведении 1:25. Затем, после завершения EIA для TN FFR согласно протоколу производителя, была измерена оптическая плотность каждой лунки с помощью планшетного ридера, настроенного на 450–570 нм. Для проведения I-L-H-E-I-A сначала перенесли 60 µL плазмы в разведении 1:2 в новый исходный планшет, а затем добавили по 180 µL разбавителя IL-8 в каждую лунку для получения исходного планшета с плазмой в разведении 1:6.

Затем, после завершения проведения ИФА на ILH согласно протоколу производителя, измерьте оптическую плотность каждой лунки с помощью планшетного ридера, настроенного на диапазон от 450 до 570 нанометров. Наконец, когда все анализы ИФА будут завершены, перенесите неиспользованную плазму обратно в пробирку и заморозьте для дальнейшего использования. На данном графике показана оптическая плотность для стандартной кривой семи различных планшетов ИФА при измерении концентраций reg three alpha, соответствующих 1084 пациентам, протестированным для первоначального отчета по биомаркеру reg three alpha при желудочно-кишечной реакции «трансплантат против хозяина». Стабильные значения оптической плотности между планшетами обеспечивают согласованность измерений концентрации белка в различных экспериментах.

Концентрации белков в образцах плазмы рассчитывали путем сравнения оптической плотности образцов с оптической плотностью стандартной кривой. Для дальнейшего повышения воспроизводимости, а также для уменьшения объема используемой плазмы за счет использования многолуночных планшетов для ELISA и других форматов, может быть применена роботизированная платформа для работы с пробами. При планировании данной процедуры важно сначала проводить анализы на неразбавленной плазме, чтобы ее можно было восстановить и использовать в последующих экспериментах после завершения разработки.

Этот метод открыл исследователям в области протеомики путь к поиску потенциальных биомаркеров при любом интересующем заболевании благодаря универсальному применению последовательных анализов ELISA. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить валидацию нескольких биомаркеров с помощью последовательного анализа ELISA, используя небольшие объемы плазмы и сводя к минимуму количество холостых циклов.