Использование LysoTracker обнаружить запрограммированной смерти клеток в эмбрионы и дифференциации эмбриональных стволовых клеток

Целью данной процедуры является демонстрация того, как окрашивать лизосомы в двух типах образцов — эмбрионах мышей и дифференцированных стволовых клетках — с помощью красителя LysoTracker для выявления паттернов гибели клеток. Для подготовки образцов эмбрионов сначала проводят их хирургическую изоляцию и помещают в чашку; для подготовки дифференцированных клеток используют эмбриональные стволовые клетки для формирования эмбриоидных тел.

Эти эмбрионы культивируют в суспензии, после чего выращивают в виде монослоя на предметном стекле с камерой. Эмбрионы в монослое инкубируют с LysoTracker Red, затем промывают и фиксируют. После этого образцы фотографируют для изучения и количественной оценки результатов окрашивания LysoTracker. Окрашивание представляет собой простую процедуру, которую можно использовать для анализа программируемой клеточной смерти в эмбрионах и культивируемых клетках.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как TUNEL-анализ, является то, что благодаря малому размеру молекулы красителя OT-трекера анализ толстых срезов ткани можно проводить быстро и легко. Хотя этот метод позволяет изучить закономерности программируемой гибели клеток в эмбрионах мышей и дифференцированных культурах, его также можно применять к другим типам тканей, например, к эмбрионам цыплят и дифференцирующимся стволовым клеткам взрослых особей. Поместите молодых самок мышей в клетки с самцами и на следующие утра проверяйте наличие вагинальной пробки, что свидетельствует о состоявшемся спаривании.

Полдень дня, когда появляется вагинальная пробка, фактически считается 0,5 днями. После коитуса в интересующий эмбриональный день усыпите самку в соответствии с утвержденными протоколами и извлеките матку в чашку Петри диаметром 10 сантиметров с раствором Хэнкса BSS, после чего промойте её, чтобы удалить кровь. Разделите эмбрионы и извлеките их из матки.

Удалите лишние эмбриональные оболочки и промойте эмбрионы раствором Хэнкса (BSS) как минимум один раз, чтобы удалить остатки тканей и крови. Во время очистки держите препарированные эмбрионы на льду. Остальные.

Приготовьте пять миллилитров раствора Liso tracker для окрашивания эмбрионов. Этого объема достаточно для одного или двух сборов эмбрионов. Осторожно перемешайте раствор для дисперсии красителя, затем перенесите эмбрионы в раствор и инкубируйте их при 37 °C в течение 45 минут.

После инкубации осторожно промойте эмбрионы в растворе Hank's BSS четыре раза по пять минут за каждую промывку. Важно проводить промывки осторожно, чтобы не повредить ткани. Медленно удалите жидкость, внимательно следя за расположением хрупких эмбрионов и всегда оставляя часть жидкости, покрывающей их.

Затем зафиксируйте эмбрионы в 4% параформальдегиде на ночь. На следующий день один раз промойте эмбрионы в растворе Hank's BSS в течение 10 минут для удаления фиксатора. После этого дегидратируйте ткани в серии растворов метанола для устранения фонового окрашивания.

Этот этап позволяет улучшить соотношение сигнал/шум при визуализации перед хранением. При необходимости возьмите образец ткани каждого эмбриона для генетического анализа. Впоследствии регидратируйте образец ткани перед генотипированием.

Разнесите эмбрионы по отдельным пробиркам с этикетками, соответствующими образцам тканей. Теперь изолированные эмбрионы можно хранить неопределенный срок в метаноле при температуре минус 20 °C. В защищенном от света месте.

Начните с подготовки эмбриональных тел методом висячей капли. При начальной плотности 500 клеток на каплю объемом 20 µL через три дня перенесите эмбриональные тела в суспензионные культуры в 10-сантиметровые неадгезивные чашки Петри. Культивируйте их в течение пяти дней, заменяя среду каждые два дня по истечении этого пятидневного периода.

Перенесите тела эмбрионов на желатинизированные восьмикамерные предметные стекла, помещая по одному или два тела эмбриона в каждую камеру. Культивируйте тела эмбрионов еще в течение 10 дней. Меняя среду через день по прошествии 10 дней, аккуратно аспирируйте имеющуюся среду и добавьте по 300 µL раствора для окрашивания клеток LysoTracker в каждую камеру.

Осторожно удалите среду с помощью пипетки, поместив кончик пипетки в угол камеры. Таким образом вы избежите случайного удаления особей, которые все еще прикрепляются к стеклянной поверхности. При повторном добавлении среды поместите кончик пипетки в угол камеры и вливайте среду очень медленно.

Инкубируйте камеры при 37 °C в течение 15 минут. Затем дважды промойте их DPBS по пять минут на каждое промывание. Теперь зафиксируйте клетки в 4% паральдегиде в течение 15 минут при комнатной температуре.

Затем удалите фиксатор, дважды промыв образцы DPBS по пять минут. Чтобы закрепить эмбрионы, поместите их на предметное стекло с глубоким углублением или в небольшую чашку Петри со специальным экраном. Подготовьте клеточные образцы для микроскопии, аспирировав DPBS.

Снимите камеру со стекла-предметника и дайте ей высохнуть на воздухе примерно пять минут. Накройте фольгой, чтобы защитить флуоресцентный сигнал. Затем добавьте водную среду для заключения, например vector shield с dappy, и накройте покровным стеклом.

Теперь предметное стекло закреплено и готово к визуализации. Осмотрите образцы с помощью стереомикроскопа или светового микроскопа, оснащенного фильтром Rhodamine, Dome или Texas Red. Окрашивание обычно достаточно интенсивное, поэтому при работе в ручном режиме длительная выдержка, как правило, не требуется.

Сделайте цифровые фотографии всех образцов при одинаковых условиях экспозиции. Для количественного анализа изображений откройте их в Adobe Photoshop или аналогичной программе для обработки изображений. Чтобы определить интенсивность окрашивания LysoTracker, выберите красный канал.

Зафиксируйте количество пикселей для всего изображения, которое отображается функцией гистограммы. Затем проведите пороговую обработку изображения таким образом, чтобы красное окрашивание было представлено белыми пикселями. Это преобразует изображение в черно-белое.

Выберите пороговый уровень и используйте его для всех изображений в наборе. Выделите белые пиксели с помощью инструмента цветового диапазона и используйте функцию гистограммы для получения общего количества белых пикселей. Используйте синий канал для подсчета количества ядер в поле зрения.

Может быть полезно вести учет количества путем аннотирования изображения, записывать значения и использовать их для расчета среднего уровня окрашивания на одну клетку. Повторите этот анализ с той же настройкой порога для всех остальных изображений. В качестве образцов для окрашивания эмбрионов мутантов sonic hedgehog использовался LyO-Tracker.

Поскольку ly O tracker представляет собой небольшую, легко диффундирующую молекулу, окрашивание целых эмбрионов на 10,5-е сутки после коитуса показало, что в глубоких областях мезенхи программируемая клеточная гибель (ПКГ) была значительно усилена в эмбрионах с нулль-мутацией гена sonic hedgehog, особенно в областях конечностей и сомитов. Для оценки общего паттерна зачатки конечностей были провизуализированы в целом препарате при большем увеличении. Диссецированные фрагменты также были подвергнуты секционированию с помощью вибротома.

Наконечник стрелки указывает на усиление окрашивания методом TUNEL в дистальном кончике эмбрионов с делецией sonic hedgehog в срезах, полученных с помощью криостата. Окрашивание TUNEL проводилось в сочетании с LysoTracker; несмотря на отсутствие строгой корреляции один к одному между окрашиванием LysoTracker и TUNEL, общие области программируемой клеточной смерти (PCD) при большем увеличении значительно перекрываются. Можно увидеть клетки, которые дали положительный результат при анализе TUNEL, но не LysoTracker, клетки, окрашенные только LysoTracker, а также клетки с перекрестным окрашиванием. После 10 дней культивирования тела эмбриона клетки дифференцировались в различные типы клеток, включая нейроны, мышечные клетки и кардиомиоциты.

В нормальной культуре дифференцированных ЭСК обнаруживается лишь несколько клеток, подвергшихся PCD, что было выявлено с помощью окрашивания LysoTracker и TUNEL-анализа. Затем клетки подвергали воздействию перекиси водорода для индуцирования гибели клеток вследствие окислительного стресса. Низкая доза перекиси водорода привела к усилению окрашивания как LysoTracker, так и TUNEL по сравнению с контролем без обработки.

Аналогично результатам, полученным на эмбрионе, оба метода окрашивания выявили как общие, так и уникальные группы клеток. Высокая доза перекиси водорода привела к сморщиванию клеток и более широкому распространению позитивности по OT-трекеру и методу TUNEL. Для сравнения использовали сывороточное голодание для индукции аутофагии после одного часа голодания.

Окрашивание OT-трекера усилилось. Однако уровень TUNEL-положительных клеток остался в пределах нормы. Таким образом, хотя метод reer является простым и полезным, важно проводить дополнительные анализы после количественного определения образцов, чтобы установить, соответствует ли окрашивание апоптозу или аутофагии.

С помощью простого метода обработки в Photoshop, продемонстрированного ранее, результаты подтвердили, что повышение концентрации перекиси водорода приводило к более интенсивному окрашиванию LysoTracker. После освоения эта процедура окрашивания может занять менее двух часов при условии ее правильного выполнения. В дополнение к данному протоколу могут быть применены другие методы, такие как иммуноокрашивание на Annexin V или LC3, для подтверждения типа гибели клеток. Следует помнить, что в настоящее время LysoTracker Green работает только с живыми клетками, поэтому для образцов, требующих фиксации, оптимальным вариантом является LysoTracker Red.