Итерационные Оптимизация дуплексов ДНК для кристаллизации SeqA ДНК-комплексов

В данном эксперименте подробно описывается получение кристаллов белка, связанного с ДНК, содержащей тандемный полуметилированный участок GATC, подходящих для дифракционного анализа. Повторение данного участка способствует более плотной упаковке кристаллов комплекса белок-ДНК. Начните с рационального подбора длины ДНК, интервала между GATC и концов ДНК, затем используйте комплементарные одноцепочечные олигонуклеотиды для очистки ДНК и последующего отжига для формирования полуметилированного дуплекса ДНК, после чего добавьте очищенный белок seq A для формирования комплекса.

Затем с помощью скрининга с использованием коммерческих наборов разреженных матриц определите оптимальные условия для выращивания кристаллов комплекса белка с ДНК, пригодных для дифракции. Продемонстрируйте полученные результаты. Опишите влияние изменения длины ДНК, интервалов GATC и концевых участков на дифракционное качество кристаллов CQ A DNA.

Целью данной работы является получение кристаллов CK, связанных с ДНК, подходящих для дифракционного анализа; кроме того, она может помочь в понимании общих переменных, которые необходимо учитывать при проектировании ДНК-дуплексов для кристаллизации других белково-нуклеиновых комплексов. Данная процедура будет использоваться Чангом А., докторантом моей лаборатории. В этом исследовании используется вариант регуляторных белков репликации ДНК Seek a, который образует стабильные димеры и имеет укороченный линкерный участок между доменами олигомеризации и связывания с ДНК.

Этот вариант ограничивает связывание ДНК тандемными повторами GATC, разделенными строго одним витком ДНК. Сначала трансформируйте клетки BBL 20 1D тремя плазмидами, кодирующими DEMETRIC seq A под контролем промотора T7. Высейте реакционную смесь трансформации на чашки с агаром LB, содержащим 100 µg/mL ампициллина, и поместите в бактериальный инкубатор на ночь. Отоберите смешанные колонии и создайте маломасштабную ночную культуру.

На следующее утро инокулируйте один литр культуры 10 миллилитрами ночного инокулята. Когда культура перейдет в логарифмическую фазу, добавьте два миллилитра 0,5 молярного IPTG для индукции экспрессии белка. Продолжайте инкубацию в течение трех часов в орбитальном шейкере при 37 °C.

Затем соберите клетки путем центрифугирования при 3,300 G в течение 10 минут. Ресуспендируйте клеточный осадок в буфере для очистки A, проведите соникацию и очистите лизат путем центрифугирования при 39,000 ×g в течение 40 минут. Теперь нанесите полученный супернатант на гепариновую колонку, уравновешенную буфером для очистки.

Для элюции белка CK используйте линейный градиент до 1 molar NaCl. Белок CK элюируется при концентрации около 0.7 molar NaCl. Соберите фракции, содержащие CK, и разбавьте их для снижения ионной силы образца.

Затем нанесите образец на колонку для катионообменной хроматографии, уравновешенную очищающим буфером. Примените линейный градиент соли для элюирования чистого белка CK при концентрации хлорида натрия около 0.4 M. Объедините фракции, содержащие CK.

Доведите концентрацию до 3 mg/mL и поместите на хранение. Буферный дизайн комплементарных неметилированных и метилированных олигонуклеотидов. Подготовьте образцы по 1 µmol каждого лиофилизированного одноцепочечного ДНК в 800 µL автоклавированной дважды дистиллированной воды, перемешайте на вортексе и оставьте на 15 минут, а также 800 µL.

Добавьте предварительно нагретый двухкратный буфер для нанесения в каждый образец. Для олигонуклеотидов длиной от 20 до 30 нуклеотидов приготовьте большой 10%-ный денатурирующий гель. После полимеризации извлеките гребенку и тщательно промойте лунки. Соберите систему, заполнив верхний и нижний резервуары однократным рабочим буфером TBE.

Проведите предварительный электрофорез геля при 750 вольтах, чтобы нагреть его до 55 градусов Цельсия. Затем остановите процесс и тщательно промойте лунки рабочим буфером. После этого нагрейте олигонуклеотиды до 90 градусов Цельсия в течение двух минут.

Перемешайте на вортексе и центрифугируйте. Образцы следует немедленно нанести на гель. Электрофорез проводите при напряжении около 700 вольт до тех пор, пока олигонуклеотид не мигрирует.

На 10% полиакриламидном геле альфа-феноловый синий мигрирует на середину вместе с олигонуклеотидами длиной около 20 оснований, а ксилен-флуоресцеин — с олигонуклеотидами длиной около 60 оснований. Извлеките гель из аппарата и снимите проставки на плоской поверхности. Снимите одну стеклянную пластину и накройте гель полиэтиленовой пленкой.

Затем переверните гель, снимите вторую стеклянную пластину и накройте гель пищевой пленкой. Далее отметьте полосы, используя УФ-свет и флуоресцентную пластину, помещенную за гелем. Чтобы видеть тень ДНК, вырежьте полосу лезвием и разделите ее на мелкие фрагменты.

Перенесите каждый образец в стерильную пробирку объемом 15 мл. Добавьте 9 мл элюирующего буфера и инкубируйте в течение ночи при 37 °C при перемешивании. Осторожно перенесите раствор в центрифужную пробирку для автоклавирования, используя наконечник для нанесения образцов в гель.

Чтобы избежать переноса фрагментов акриламида, добавьте 1 mL 3 M ацетата натрия (pH 7) и 25 mL охлажденного 100% этанола, затем инкубируйте при -20 °C не менее трех часов. Центрифугируйте осадок ДНК. Затем высушите осадки в вакуум-концентраторе (speed vac) при среднем нагреве, ресуспендируйте каждый осадок в 400 µL автоклавированной дважды дистиллированной воды и перенесите в новую пробирку.

Добавьте 40 µL 3 M ацетата натрия при pH 7 и 1 мл 100% этанола, перемешайте на вортексе и инкубируйте в течение 30 минут при -20 °C, после чего центрифугируйте 15 минут при 18 000 ×g. Промойте осадок ДНК 100 µL холодного 70% этанола для удаления остатков солей, центрифугируйте 6 минут при 18 000 ×g, затем удалите этанол и высушите осадок в вакуум-концентраторе (SpeedVac).

Теперь ресуспендируйте каждый осадок в 100 µL автоклавированной дважды дистиллированной воды. Определите концентрацию олигонуклеотидов с помощью спектрометрии. Для подготовки полуметилированных дуплексов ДНК сначала смешайте равные молярные концентрации комплементарных одноцепочечных нитей.

Затем нагрейте смеси до 95 °C на водяной бане в течение пяти минут для денатурации цепей. Дайте образцам медленно остыть до комнатной температуры непосредственно в водяной бане. Смешайте равные объемы очищенного белка CQ в концентрации 81 µM и полуметилированной ДНК в концентрации 81 µM.

Затем инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Хранить при температуре 4 °C до использования; для подбора условий кристаллизации использовали коммерческие наборы разреженных матриц. После выявления первичных условий кристаллизации оптимизировали их для получения кристаллов, пригодных для дифракции. Полученные кристаллы CK DNA подвергли криопротекции.

Либо увеличьте количество PEG 400 в кристаллизационном растворе до конечной концентрации 25%, либо добавьте в кристаллизационный раствор 20% глицерина. Извлеките отдельные кристаллы с помощью нейлоновой петли. Заморозьте образцы в жидком азоте.

Теперь проверьте дифракционный предел каждого кристалла при 100 K. Для получения кристаллической структуры укороченного мутанта CK, связанного с полуметилированной ДНК, мы последовательно оптимизируем три параметра ДНК: расстояние между полуметилированными последовательностями GATC, длину дуплекса, а также наличие или отсутствие 5'-овеобразных концов. В данном исследовании используется вариант DME seek a с точечной мутацией в концевом терминальном домене, которая предотвращает дальнейшую лигандизацию, и укороченный линкер, ограничивающий связывание ДНК тандемом.

Результаты анализов сдвига электрофоретической подвижности ДНК с GATC-повторами, разделенными строго одним витком, указывают на то, что модифицированный белок CK преимущественно связывается с GATC-повторами, разделенными девятью или десятью парами оснований. Следовательно, при первичном скрининге используются дуплексы длиной от 23 до 24 пар оснований, содержащие два полуметилированных GATC-повтора, разделенных девятью или десятью парами оснований.

Три дуплекса дали кристаллы хорошей формы. Несмотря на то, что ни один из кристаллов не обеспечил дифракцию высокого разрешения, данные указали на то, что для кристаллизации предпочтительным было разделение A-G-A-T-C на девять базовых пар; неожиданно оказалось, что усиление взаимодействий в большой бороздке с основным скелетом путем включения CG-динуклеотида между двумя сайтами GATC не изменило предел дифракции кристаллов.

Напротив, оптимизация длины выступающих концов привела к резкому изменению молекулярных контактов и морфологии кристаллов. Структура кристалла этого белка CK, связанного с частично метилированным дуплексом ДНК, подтвердила, что свободная грань дуплекса ДНК не участвует в кристаллических контактах, несмотря на относительный размер белка и ДНК; большинство взаимодействий между симметричными партнерами опосредованы взаимодействиями белок-белок и белок-ДНК. Интересно, что в данном конкретном случае положительный эффект от пятиштрихового динуклеотидного выступа не связан с формированием псевдонепрерывной ДНК.

Напротив, 5'-конец метилированной цепи направлен в сторону от оси ДНК и взаимодействует с проксимальной молекулой CK комплекса; это объясняет, почему для изменения кристаллической упаковки требовалось строго два нуклеотида. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как очищать белки и конструировать дуплексы ДНК для кристаллизации белково-нуклеиновых комплексов. Важно помнить, что, хотя данный протокол был разработан для кристаллизации комплекса CK-ДНК, рациональная оптимизация длины, последовательности и концов ДНК представляет собой общую основу для конструирования дуплексов ДНК с целью кристаллизации других комплексов белка с ДНК.