Экспертиза тимуса позитивной и негативной селекции с помощью проточной цитометрии

Общая цель следующего эксперимента — изучить развитие тимоцитов у мышей с помощью проточной цитометрии. Это достигается путем подготовки суспензий единичных клеток из тимуса и селезенки мыши. На втором этапе тимоциты и клетки селезенки окрашиваются коктейлем антител для идентификации специфических популяций тимоцитов.

В конечном итоге частоту и количество различных популяций лимфоцитов можно оценить с помощью проточной цитометрии. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы о развитии Т-клеток, например, о том, какие гены и сигнальные пути важны для формирования функционального, но при этом толерантного репертуара Т-клеток. Хотя данный метод дает представление о развитии Т-клеток в тимусе, его также можно применять для изучения развития других иммунных клеток.

Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, сталкиваются с трудностями при подборе коктейлей антител для проточной цитометрии. Перед началом диссекции поместите стерильное стальное сито в чашку Петри размером 60 x 15 мм. Затем добавьте в чашку 5 мл HBSS и храните её на льду для сбора тимуса.

Сначала с помощью пинцета приподнимите нижний конец грудины, чтобы обнажить диафрагму. Затем, стараясь не задеть печень, разрежьте диафрагму, чтобы отделить грудную клетку, и сделайте разрезы грудной клетки в направлении вверх с каждой стороны. При этом будьте осторожны, чтобы не повредить легкие и сердце.

Теперь с помощью пинцета осторожно раздвиньте ребра. Тимус представляет собой белый двудольный орган, расположенный над сердцем. Используйте плоскую сторону пинцета, чтобы захватить нижнюю часть долей.

Затем аккуратно извлеките тимус и поместите его на одну из заранее подготовленных сеточных подложек. Для забора селезенки сделайте разрез через брюшину, чтобы открыть брюшную полость. Селезенка представляет собой красный орган в форме серфборда, расположенный в левой части брюшной полости мыши под печенью.

Затем с помощью одного пинцета извлеките селезенку, а другим — удалите соединительную ткань. Поместите препарированную селезенку на отдельный сетчатый фильтр. Теперь с помощью поршня шприца объемом 3 мл разотрите орган по сетке до тех пор, пока не останется только соединительная ткань и жир; перенесите клетки и HBSS в коническую пробирку объемом 15 мл.

Затем промойте каждую сетку свежим HBS S 3 раза. Далее центрифугируйте клетки в течение пяти минут при 335 ×g и температуре 4 °C. После аспирации супернатанта ресуспендируйте циты в 500 µL лизирующего буфера CK в течение 10 минут при комнатной температуре для лизиса эритроцитов селезенки.

Ресуспендируйте тимоциты в FACS-буфере до концентрации 20 × 10⁶ клеток/мл и поместите их на лед. Затем добавьте 5 мл HBSS для восстановления изотоничности; после повторного центрифугирования суспендируйте осадок, очищенный от эритроцитов, в FACS-буфере до концентрации 20 × 10⁶ клеток/мл. Начните этот этап с аликвотирования.

Добавьте 4×10⁶ резервных ТИМОЦИТОВ на образец для проточной цитометрии в каждую лунку 96-луночного планшета. Затем добавьте цитоциты в лунки 96-луночного планшета для контролей компенсации. После этого заблокируйте FC-рецепторы в каждом из образцов клеток путем инкубации с anti CD 1632 в течение 10 минут на льду.

Теперь центрифугируйте планшет, затем удалите жидкость из лунок, один раз резко перевернув планшет отверстиями вниз над раковиной. После этого ресуспендируйте содержимое каждой лунки в 200 µL FACS-буфера и повторите промывку. Затем инкубируйте экспериментальные образцы с 200 µL коктейля антител или антител, конъюгированных с одним флуорохромом, для контролей компенсации. Все этапы выполняйте в FACS-буфере на льду в темноте.

Через 30 минут дважды промойте клетки буфером для FACS, затем, после повторного суспендирования клеток в буфере для FACS, перенесите образцы в пробирки для FACS (для физиологических трансгенных моделей TCR и мышей дикого типа). Положительная селекция начинается на стадии ярко-двойных положительных клеток (double positive bright), прежде чем они перейдут в стадию тускло-двойных положительных клеток (double positive dull). После контакта с антигеном тускло-двойные положительные тимоциты переходят в переходную стадию CD4-положительных CD8-низких клеток, прежде чем стать CD4-положительными.

Одиночно положительные или CD8-одиночно положительные тимоциты. Зрелые одиночно положительные тимоциты характеризуются высокой экспрессией TCR и потерей CD24. В то время как профиль CD8/CD4 может выявить дефекты положительного отбора, анализ TCR-бета/CD69 или TCR-бета/CD5 может дать более глубокое понимание природы этого дефекта. Экспрессия как CD69, так и CD5 повышается после стимуляции TCR, при этом более сильные взаимодействия приводят к более высокой экспрессии этих маркеров.

На данной диаграмме TCR beta по CD 69 для мыши дикого типа гейт TCR beta low CD 69 negative представляет популяцию двойных положительных тимоцитов до селекции. В то время как гейт TCR beta intermediate CD 69 positive представляет переходную популяцию непосредственно после взаимодействия с TCR и состоит из ярко-двойных положительных, некоторых тускло-двойных положительных, а также CD 4 positive CD 8 low клеток. Здесь гейт TCR beta high CD 69 positive иллюстрирует популяцию клеток непосредственно после позитивной селекции, которая состоит из тускло-двойных положительных, CD 4 positive, CD 8 low и CD 4 одинарно положительных клеток.

Наконец, эта гейт с высоким уровнем экспрессии TCR-β и отсутствием CD69 демонстрирует более зрелую популяцию клеток, которая состоит преимущественно из CD4- и CD8-одиночно положительных клеток. Отсутствие популяций с промежуточным уровнем TCR-β/CD69-положительных и высоким уровнем TCR-β/CD69-положительных клеток может указывать на нарушение позитивного отбора. Изменения в соотношении CD4-одиночно положительных и CD8-одиночно положительных клеток в популяции с высоким уровнем TCR-β и отсутствием CD69 могут свидетельствовать об изменениях в определении клеточной линии.

Исчезновение популяций TCR β high CD 69 positive и TCR β high CD 69 negative может свидетельствовать о проблемах с выживаемостью после позитивной селекции. Еще одним способом идентификации популяций до и после позитивной селекции является анализ TCR β по CD 5. Эти две первые популяции состоят преимущественно из ярко выраженных двойных положительных тимоцитов.

Популяция TCR beta low CD five low представляет собой преселекционные двойные положительные тимоциты, а популяция TCR beta intermediate CD five intermediate состоит из клеток, инициирующих позитивную селекцию. Нарушение формирования этой или предыдущей популяции указывает на дефект позитивной селекции. Популяция TCR beta intermediate CD five high, напротив, представляет тимоциты, находящиеся в процессе позитивной селекции, и состоит преимущественно из двойных положительных тусклых и CD four положительных клеток.

Тимоциты с низким уровнем CD8. Популяция с высоким уровнем TCRβ и высоким уровнем CD5 состоит преимущественно из клеток, прошедших положительный отбор. Одиночно-положительные тимоциты: изменения в соотношении CD4-одиночно-положительных и CD8-одиночно-положительных клеток.

Наличие одиночных положительных клеток в данной популяции, несмотря на нормальный состав предшествующих популяций, может указывать на изменения в определении клеточной линии. Кроме того, отсутствие этой популяции может свидетельствовать о снижении выживаемости тимоцитов после положительной селекции, поскольку негативная селекция предполагает делецию небольших антигенспецифических популяций. Дефекты этого процесса лучше всего наблюдаются с использованием ТCR-трансгенных мышей; в тимоцитах мышей HY CD4, экспрессирующих трансгенный H-Y-T-C-R, эти клетки можно обнаружить с помощью моноклональных антител T 3.7.

H-Y-T-C-R распознает специфический для самцов антиген HY, представленный в рамках MHC класса I db. Таким образом, у самцов мышей HY CD four происходит негативная селекция H-Y-T-C-R-положительных тимоцитов, что проявляется в снижении количества T three point 70-положительных двойных положительных тимоцитов и более выраженном снижении количества T 3.7-положительных CD eight-одиночных положительных тимоцитов. Напротив, у самок мышей HY CD four происходит позитивная селекция, приводящая к образованию T 3.7-положительных CD eight-одиночных положительных T-клеток.

Хотя снижение количества дважды положительных тимоцитов указывает на отрицательную селекцию, наиболее точным показателем является отсутствие антигенспецифических одноположительных тимоцитов. Дальнейшее исследование немногих T3.70-положительных CD8-одноположительных тимоцитов у самцов мышей HY CD4 показывает, что большинство из них представляют собой незрелые CD24-высокие клетки. В то же время большинство T3.70-положительных CD8-одноположительных тимоцитов у самок HY CD4 достигли зрелости и являются CD24-низкими, что служит дополнительным подтверждением того, что в организме самцов мышей HY CD4 происходит отрицательная селекция.

Одним из недостатков трансгенных моделей TCR является то, что дальнейшая характеристика положительной селекции затруднена из-за сложности идентификации популяций на основе экспрессии TCR и CD 69 или CD 5 ввиду высокого уровня экспрессии TCR на протяжении всего развития тимоцитов. У самок мышей HY CD 4 наблюдается большая популяция двойных положительных тимоцитов T 3.70-положительных, которые подвергаются положительной селекции. Отрицательная селекция требует более сильного стимула TCR с более высоким сродством, чем положительная селекция, о чем свидетельствует увеличение популяции CD 69-положительных клеток по сравнению с диким типом. Это подтверждается более высокой экспрессией CD 69 на T 3.70-положительных двойных положительных тимоцитах у самцов мышей HY CD 4, что приводит к смещению пика гистограммы вправо.

Аналогичные тенденции наблюдаются при экспрессии CD 5 при анализе тимического отбора у генетически модифицированных мышей. Анализ экспрессии CD 69 или CD 5 позволяет определить, заключается ли дефект в передаче сигналов TCR или в последующем результате стимуляции TCR. После освоения данной методики подготовка и окрашивание клеток занимают два с половиной часа, а сбор данных на проточном цитофлуориметре — еще один час.

При правильном выполнении на каждую дополнительную мышь потребуется примерно 30 минут. При проведении данной процедуры важно помнить о необходимости бережного обращения с тимоцитами и заранее спланировать стратегию окрашивания. После завершения данной процедуры.

Для получения ответов на дополнительные вопросы, например, о том, функционируют ли экспортированные тимоциты надлежащим образом, можно провести другие анализы, такие как тесты на цитотоксичность или анализы продукции цитокинов. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как анализировать развитие зон тимуса с помощью проточной цитометрии.