Количественные исследования локомоции свободно плавающих микроорганизмов с помощью лазерной дифракции

Общая цель данной процедуры — измерение частоты извиваний свободно плавающих микроскопических организмов. Для этого сначала подготавливают образец микроскопических червей, после чего подготавливают оптическую установку.

Затем регистрируется дифракционная картина, создаваемая живыми организмами. В завершение проводится анализ зарегистрированных данных для определения частоты плавания. В итоге дифракционный анализ используется для демонстрации изменений в паттернах локомоции свободно перемещающихся червей.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими, такими как традиционная микроскопия, является возможность наблюдения за паттернами плавания вида при его свободном перемещении в трехмерном пространстве. Хотя этот метод позволяет изучить особенности свободного плавания C. elegans, его также можно применять к другим прозрачным, мелким и микроскопическим организмам, подвергающимся воздействию различных условий. Чтобы подготовить C. elegans для видеоанализа, с помощью сплющенного платинового зонда перенесите от 10 до 20 взрослых нематод на свежую среду NGM.

Чашки Петри с агаром, содержащие небольшие круговые пятна e coli. Дайте нематодам отложить яйца в течение трех-пяти часов, после чего удалите взрослых особей. Таким образом создается небольшая синхронизированная по развитию культура из 50–150 нематод; для их выращивания до раннего взрослого состояния инкубируйте чашки Петри при 20 °C в течение четырех-пяти дней.

В день проведения видеоанализа используйте 1 мл деионизированной дистиллированной воды для смыва молодых взрослых нематод с чашки, собрав таким образом от 50 до 150 червей из синхронизированной культуры. Используйте микроцентрифугу, чтобы осадить червей на дно пробирки, или дайте им осесть под действием силы тяжести в течение примерно 15 минут. Удалите большую часть воды из пробирки и замените ее 1 мл деионизированной дистиллированной воды, чтобы смыть с нематод любые прилипшие бактерии.

С помощью микропипетки перенесите от пяти до 10 нематод в воде в кварцевую кювету. Соберите оптическую схему, как показано здесь, используя гелий-неоновый лазер с длиной волны 543 нанометра, два алюминиевых зеркала с передним отражающим слоем для управления лучом лазера, проходящим через кювету, держатель для кюветы, проекционный экран и высокоскоростную камеру, способную проводить съемку со скоростью примерно 240 кадров в секунду. Затем с помощью кусочка парафильма закройте верхнюю часть кюветы и переверните ее, чтобы распределить нематод в столбе воды.

Поместите vete в держатель для vete таким образом, чтобы черви изначально находились в верхней части vete. С помощью зеркал направьте лазерный луч через центр vete. Поскольку нематоды плотнее воды, они будут медленно опускаться на дно vete, плавая в толще воды; на проекционном экране закрасьте черным цветом пятно, соответствующее прошедшему лазерному лучу, чтобы уменьшить рассеяние в месте падения луча на экран.

Устранение или уменьшение рассеивания прошедшего пучка предотвратит насыщение ПЗС-матрицы камеры из-за воздействия этого пучка. Чтобы определить размер дифракционной картины, проведите линию длиной около пяти сантиметров на проекционном экране рядом с пятном прошедшего лазерного луча, стараясь не перекрывать изображение дифракционного света. Выключите свет в помещении и регистрируйте дифракционные изображения на экране в моменты прохождения червей через лазерный луч.

Для подготовки видеоданных установите следующую программу для видеоанализа и импортируйте в нее видеозапись. С помощью программного обеспечения установите начало координат так, чтобы оно совпадало с transmitted laser spot. Отследите угловое смещение дифракционной картины, формируемой каждой нематодой.

Скопируйте и вставьте данные в таблицу и прибавьте 180 градусов или PI ко всем отрицательным углам, чтобы получить непрерывный график. Используя установку для видеоанализа, поместите фотодиод с малой площадью вне центра дифракционной картины непосредственно перед проекционным экраном через USB-порт.

Подключите фотодиод к цифровому осциллографу, соединенному с компьютером. Наблюдайте за паттернами биений на экране компьютера. Сохраните наборы данных в формате ASCII или текстовом формате для последующего анализа.

Используйте видео или фотографию для импорта данных в программу анализа данных, позволяющую выполнять аппроксимацию волновых форм. С помощью метода минимизации хи-квадрат проведите аппроксимацию синусоидальной кривой для определения частоты биения. Вычислите среднее значение частот плавания для различных образцов и определите дисперсию.

Для данного исследования данные подвергались статистическому анализу с использованием однофакторного ANOVA с последующим тестом Бонферрони для множественных сравнений. Значение P менее 0,05 считается статистически значимым для моделирования дифракционных картин. Начните с использования микроскопа для получения изображений с целью их анализа.

Перетащите изображение в Mathematica. Используйте команду binary eyes для преобразования его в черно-белый формат. В качестве альтернативы используйте команду edge detect для создания черно-белого изображения, где два последних числа определяют степень грубости получаемых границ.

Затем с помощью команды image data преобразуйте изображение в матрицу из нулей и единиц. Используйте команду forer для выполнения преобразования Фурье, после чего возведите модуль матрицы в квадрат и просмотрите полученное изображение, которое представляет собой дифракционную картину, соответствующую исходному изображению. Кроме того, используйте функцию log для масштабирования контрастности изображения.

Наконец, сравните модельные дифракционные картины с дифракционными картинами, полученными от свободно плавающих червей. В данном примере изучали sea elegance в кварцевой кювете шириной 1 см, толщиной 5 мм и высотой 4 см. Отбор одного червя с использованием видеоанализа.

Средняя частота плавания, полученная в результате видеоанализа в кювете толщиной пять миллиметров, составила около 2.5 hertz. Аналогичным образом, при отборе проб одного червя с использованием метода сбора данных в реальном времени и цифрового осциллографа частота плавания составила около 2.7 hertz. Данную процедуру можно повторить для многих червей.

Детальное исследование свободно плавающих червей выявило среднюю частоту плавания 2.37 hertz для особи размером пять миллиметров. Как и ожидалось, частота плавания выше, чем частота ползания червя. С помощью данного дифракционного метода было установлено, что средние частоты плавания sea elegance, помещенного на предметное стекло микроскопа, соответствуют ранее опубликованному значению two hertz.

Согласно видео. Подготовка данных и моделирование дифракционных картин, продемонстрированные в данном видео, позволяют моделировать дифракционные картины плавания. С помощью изображений червей, полученных с помощью обычного микроскопа, смоделированные дифракционные картины используются для симуляции цикла плавания sea elegance.

Успешная модель характеризуется физически реализуемостью паттернов плавания, соответствующих частотам плавания. По завершении цикла плавания червь должен принимать ту же форму, что и в начале цикла. После освоения данной методики обработка каждого червя может занимать менее минуты при использовании режима быстрой фотосъемки с наблюдением за циклами плавания на экране компьютера.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить оценку свободно плавающих нематод.