Одноклеточный Микроинъекция для анализа сотовой связи
26 февраля 2017 г.
Здесь мы опишем, как выполнить одноклеточного микроинъекции Lucifer Yellow для визуализации сотовой связи через гэп-переходов в живых клетках, а также обеспечить некоторые полезные советы. Мы ожидаем, что эта статья поможет всем оценить степень сотовой связью за счет функциональных щелевых контактов. Все, что описано здесь, может быть, в принципе, адаптированы к другим флуоресцентных красителей с молекулярной массой менее 1000 дальтон.
Здравствуйте, меня зовут Анаэль. Я работаю в Фонде Освальдо Круза в Лаборатории сотовой связи. Здесь мы изучаем Р2-рецепторы и gap-инъекцию в контексте иммунной системы и печени.
Сегодня я представлю вам микроинъекцию клетки. Инъекции разрыва играют некоторые физиологические роли, такие как передача синапсов, сердечные сокращения и другие. Для этой техники мы можем изучить, являются ли инъекции с разрывом функциональными или нет.
Хорошо, давайте посмотрим на базовые компоненты настройки микровпрыска. Здесь у нас есть инвертированный флуоресцентный микроскоп, в котором мы видим клетки. Это ПЗС-камера для записи результатов.
У нас есть генератор тока, с помощью которого мы будем вводить краситель в клетку. Далее у нас есть держатель, куда подключается микроэлектрод. И микроманипулятор, который подключен к держателю и позволяет перемещать микроэлектрод по трем осям: Z, Y и X. Прежде чем начать эксперимент, мы должны изготовить микроэлектрод.
Мы используем этот капилляр из боросиликатного стекла и это оборудование, которое называется полярным. Сюда же прикрепляем боросиликатный капилляр. Эту вольфрамовую нить мы будем нагревать, чтобы сделать два микроэлектрода.
Теперь нагрев вольфрамовой нити и волна здесь мы потянем вниз, чтобы сделать два микроэлектрода. Лёгкий. Первым делом мы заполняем микроэлектрод красителем. Один из советов здесь заключается в том, что для проведения эксперимента вам нужно заполнить только наконечник несколькими микролитрами.
Не обязательно заполнять все подряд. Примечание с более подробной информацией. Заполните только кончик.
Приступим к эксперименту. У нас есть клетки в чашке Петри, в растворе натрия. Серебряный провод подключается к генератору тока.
Теперь нам нужно прикрепить микроэлектроды к головному столу. Здесь, в головном каскаде, у нас есть еще один серебряный провод, также подключенный к генератору тока. После того, как микроэлектрод прикреплен, мы можем поместить его внутрь ванны.
Обратите внимание, что кончик пипетки осторожно касается ванны. Эту процедуру следует производить очень аккуратно, чтобы избежать разбиения кончика о дно чашки Петри. Оказавшись внутри ванны, мы можем подойти к микроскопу, чтобы найти тень от микропипетки.
Рекомендуем начать смотреть в линзу увеличения. Когда мы находим тень пипетки, мы можем переместить микроэлектрод к клетке с помощью микроманипулятора. Как только он окажется очень близко к ячейке, мы можем провести тестовый пост, чтобы проверить, не заблокирован ли микроэлектрод.
Что мы увидим дальше. Здесь мы видим микропипетку и подгоняем микропипетку очень близко к ячейке. Мы можем видеть движение клеток вправо и влево.
Затем переходим на фильтр, флуоресцентный фильтр. Мы можем применить гиперполяризующий импульс, чтобы проверить, не заблокирован ли кончик пипетки. Поскольку микропипетка находится внутри клетки, мы можем подать гиперполяризующий импульс для загрузки клетки красителем.
Здесь мы используем рассыпчатый свободный желтый краситель. После загрузки клетки красителем, если соседние клетки соединены с помощью щелевых инъекций, мы ждем несколько минут, и мы увидим, как соседние клетки светлеют за счет диффузии красителя этими щелевыми инъекциями. В нашем эксперименте мы видим пять ячеек, отмеченных звездами, демонстрирующих флуоресценцию.
Вот хороший пример эксперимента по микроинъекции в эпителиальные клетки тимуса, в А и B.In на рисунках С и D, показан микроинъекция в инертную клетку тимуса рыхлого свободного желтого цвета и другой краситель, не проницаемый для зазора инъекции, показанный во вкладыше. На рисунке E и F линия эпителиальных клеток тимуса микроинъекционная свободная желтая и во вставку рыхлого свободного желтого цвета и зазор инъекционного блока. Результаты показывают, что свободный желтый цвет не распространился на соседние клетки.
Далее мы видим микроинъекцию в эпителиальные клетки тимуса, в присутствии дексаметазона и количественного определения в B. Дексаметазон увеличивает степень связанности, как показано на рисунке B. Из 100 инъекций количество трех или четырех соединенных клеток было более частым в присутствии этого препарата. Я надеюсь, что смогу помочь новичкам в изучении этой важной техники сотовой связи. Спасибо и до свидания.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается методика микроинъекции красителя Lucifer Yellow в отдельную клетку для визуализации межклеточной коммуникации через щелевые контакты в живых клетках. В работе приводятся практические рекомендации для исследователей по оценке клеточной связи, обусловленной наличием функциональных щелевых контактов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная коммуникация
- Нейробиология
- Иммунология
Обзор
- Щелевые контакты играют критическую роль в физиологических процессах.
- Они участвуют в синаптической передаче и сокращениях сердца.
- Понимание их функциональности имеет важное значение для различных биологических исследований.
- Lucifer Yellow — это флуоресцентный краситель, используемый для визуализации.
Цель исследования
- Продемонстрировать метод микроинъекций для изучения щелевых контактов.
- Оценить степень клеточной связи в живых клетках.
- Изучить функциональные особенности щелевых контактов.
Используемые методы
- Микроинъекция Lucifer Yellow в отдельную клетку.
- Визуализация межклеточного взаимодействия.
- Оценка функциональных щелевых контактов.
- Адаптация метода для других флуоресцентных красителей.
Основные результаты
- Успешная визуализация межклеточных взаимодействий через щелевые контакты.
- Продемонстрирована оценка межклеточного сопряжения.
- Метод применим к различным флуоресцентным красителям с молекулярной массой менее 1 000 Дальтон.
- Получены сведения о физиологической роли щелевых контактов.
Выводы
- Метод микроинъекций эффективен для изучения щелевых контактов.
- Люциферовый желтый (Lucifer Yellow) служит полезным инструментом для визуализации.
- Полученные результаты способствуют пониманию межклеточной коммуникации в живых системах.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Микроинъекция в отдельную клетку позволяет напрямую оценить функциональность щелевых контактов — ключевого механизма межклеточной коммуникации, имеющего важное значение для валидации мишеней лекарственных средств в нейронауках, иммунологии и тканевой инженерии. Визуализируя диффузию красителя в реальном времени, исследователи могут оценить влияние соединений на межклеточную связь, что способствует механистическому снижению рисков на ранних этапах поиска. Данный подход обеспечивает количественные функциональные показатели, которые повышают уверенность в выбранной мишени и помогают принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) в доклинических исследованиях.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы, определив, модулирует ли мишень коммуникацию через щелевые контакты.
- Операционная ценность: обеспечивает функциональную валидацию коннексинов или гемиканалов в качестве мишеней в живых клетках.
- Прогностическая ценность: способствует уточнению путей передачи сигналов и снижению биологических рисков посредством прямого наблюдения за переносом красителя.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных клеточных систем для скрининга соединений путем установления базового уровня сопряжения.
- Количественный выход: Измерение кинетики диффузии в качестве функционального показателя для стандартизации анализа.
- Масштабируемость: Возможность адаптации к платформам высококонтентного имиджинга для сравнения нескольких условий.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Моделирует физиологические процессы, такие как синаптическая передача и сокращение сердца, в которых участвуют щелевые контакты.
- Трансляционная непрерывность: Связывает результаты исследований in vitro с доклиническими моделями, подтверждая функциональную связь в соответствующих типах клеток.
- Принятие решений с учетом рисков: Обосновывает дальнейшие этапы разработки на основе данных о взаимодействии с мишенью в клеточных сетях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод применим на этапе раннего поиска для оценки влияния мишеней на межклеточную коммуникацию перед переходом к фенотипическому скринингу или оптимизации соединений-лидеров.
- Фундаментальная биология: Проверка гипотезы о том, что соединение или генетический модулятор изменяет межклеточную сигнализацию через щелевые контакты.
- Скрининг: Получение воспроизводимых количественных данных флуоресценции для сравнения условий воздействия.
- Аналитика: Предоставление измеряемых показателей диффузии, позволяющих провести статистическое сравнение эффективности сопряжения.
- Трансляционные исследования: Использование эпителиальных и иммунологически значимых клеточных линий для моделирования взаимодействия на уровне тканей.
- Корпоративное повторное использование: Создание универсальной платформы для оценки соединений, нацеленных на коннексины, в различных проектах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов путем подтверждения функциональной модуляции мишени в нативном клеточном контексте.
- Практическая ценность: стандартизирует протоколы микроинъекций и визуализации для получения воспроизводимых результатов в разных лабораториях.
- Стратегическая ценность: снижает риск неудач на поздних этапах за счет раннего выявления неэффективных модуляторов клеточного сопряжения.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию соединений, демонстрирующих модуляцию щелевых контактов, на основе имеющихся данных.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт в области микрохирургии, флуоресцентной микроскопии и работы с красителями.
- Результат зависит от стабильности микроманипулятора, подготовки электродов и точности внутриклеточного введения.
- Необходима стандартизация подготовки клеток и условий в ванночке для обеспечения воспроизводимости результатов.
- Необходимо учитывать вариабельность экспрессии коннексинов и базовый уровень связи в зависимости от типа клеток.
- Метод ограничен использованием красителей с массой до ~1,000 Da, способных проходить через щелевые контакты, так как более крупные молекулы остаются внутри клетки.
