Сплит-и-бассейн Синтез и свойства пептида третичный амид библиотеки

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать, как синтезировать комбинаторные библиотеки, содержащие пептидные третичные единицы или единицы ТФК. Это достигается путем предварительного получения субмономера ЧФК из природных аминокислот. Второй шаг заключается в синтезе области пептидного линкера на твердой основе.

Далее синтезируется комбинаторная библиотека, содержащая ФТА и пептидные субъединицы. Заключительным этапом является определение характеристик синтезированной библиотеки для обеспечения качества синтеза. В конечном счете, синтезируется комбинаторная библиотека, содержащая подтверждающие ограниченные субъединицы ЧФК, и такая библиотека может быть использована для высокопроизводительного скрининга, чтобы получить белковые лиганды и привести к открытию новых лекарств.

Таким образом, химия, о которой идет речь в этой статье, была разработана в попытке найти молекулы, которые были бы намного жестче, чем некоторые пептиды и другие вещества, с которыми мы работали ранее. Идея заключается в том, что если идентифицировать библиотеки более жестких молекул, то они будут связываться с белковыми мишенями с гораздо более высоким сродством, и мы подумали, что это очень, очень важно при попытке разработать лекарства или даже интересные молекулы-зонды. Визуальная демонстрация этого синтеза подотряда PTA действительно имеет решающее значение, поскольку синтез трудно освоить, потому что температура и контроль времени действительно имеют решающее значение для успешного синтеза.

Сначала добавьте 8,9 грамма обеда и 11,9 грамма бромида калия в 500-миллилитровую колбу с круглым дном с тремя горлышками и магнитной мешалкой. Затем добавьте в колбу 100 миллилитров ранее приготовленного 30%-ного раствора бромистого водорода. После помещения колбы в отрицательные 10 градусов Цельсия этиленгликоль, сухой лед в ванне с пузырьками аргона через длинную иглу со дна колбы в течение 10 минут.

Перемешивает раствор с помощью магнитной мешалки при 300 об/мин. Вслед за этим добавьте заранее приготовленный раствор нитрита натрия в выравнивающую давление капельную воронку, прикрепленную к трем горлышкам, круглое дно колбы и заклейте ее перегородкой. Медленно откройте клапан капельной воронки, позволяя раствору нитрита натрия капнуть в колбу.

Управляйте клапаном, чтобы отрегулировать скорость капания примерно до двух капель в секунду. После того, как добавление нитрита натрия будет завершено, продолжайте помешивать раствор еще три часа, позволяя температуре прогреться с минус 10 градусов Цельсия до комнатной температуры. Если цвет раствора слишком темный, примените вакуум, чтобы удалить избыток оксидов азота и возможного брома, образующегося в ходе реакции.

После того, как раствор будет перенесен в экстракционную воронку, извлеките продукт три раза с 35 миллилитрами эфира датила. Соединив органическую фазу и промывку насыщенным рассолом, соберите его в колбу и просушите над сульфатом натрия в течение шести часов. После фильтрации сульфата натрия выпарите растворитель под вакуумом до получения прозрачного или бледно-желтого масла.

Очистите сырой продукт методом силикагелевой колонной хроматографии с тремя к одному гексана этилацетата для изотопного мечения, растворите 300 мг L аланина с 10 миллилитрами дейтерированной воды в 50-миллилитровой полиэтиленовой пробирке. Добавив 10 миллиграмм альфа-кетоглутарата в качестве подложки, пробирку прогрейте до 37 градусов по Цельсию. Когда закончите, отрегулируйте pH до 8,5–8,7 с помощью одномолярного раствора оксида натрия и тест-полосок pH.

Далее добавьте в раствор 0,1 миллиграмм аланинтрансаминазы. Поместите пробирку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и инкубируйте в течение ночи с легким встряхиванием при 10–30 оборотах в минуту. В этот момент набухают один грамм 90 мкм, 10 до гелевых шариков с линкером Ram в 10 миллилитров диметилформамида в течение трех часов в 12-миллилитровом шприц-реакторе с легким встряхиванием, сливают диметилформамид из реактора и добавляют 10 миллилитров 20%-ного раствора перина диметилформамида, чтобы дезащитить группу FOC от катка среди линкера.

Встряхнув бусины с 20% раствором Пеппердина в течение 30 минут, промойте их пять раз с диметилформой мяса, чтобы удалить весь Пеппердин. Далее извлеките из шприца несколько бусин и проверьте их хлоральным тестом. Добавьте в бусины два миллилитра двухмолярного раствора бромоуксусной кислоты диметилформамида и осторожно встряхните.

Затем добавьте в бусины два миллилитра двухмолярного диопа раствора пропилкарбодиамина диметилформамида. Запаивая шприц поршнем, встряхните шарики на шейкере в течение 10 минут. После того, как бусины были тщательно промыты диметилформамидом, добавьте к ним два миллилитра заранее приготовленного раствора метоксиэтилметиламида с одним моляром.

Встряхнув бусины и промыв их пять раз диметилформамидом, проверьте несколько бусин с помощью хлорального теста. После этого добавьте в ранее использованный шприц 10 миллилитров раствора дихлорала метана диметилформамида один к одному. Равномерно разделите все шарики весом в один грамм на три пятимиллилитровых реактора шприца с помощью пипетки объемом 1000 микролитров с усеченным наконечником пипетки.

После трехкратной промывки трех шприцев метаном хлорметана трижды промыть шприцы с маркировкой R и S безводным тет гидрофурином, а меченый шприц В три раза - диметилформамидом. Для соединения тристина с бромпропаном NOIC кислотой добавьте примерно 200 мг тристина во флакон в вытяжном шкафу. После того, как флакон будет закрыт, взвесьте количество тристина, содержащегося во флаконе.

Затем добавьте в флакон соответствующее количество безводного тетра гидро феррана, чтобы получилось 20 миллиграмм на миллилитр раствора трифосгена тетра гидроферрана. Для приготовления смеси бромкислот трифосгена добавьте 89 микролитров R two Bromo propan NOIC acid и S two Bromo propan NOIC acid четыре в два небольших флакона отдельно в каждый флакон, добавьте по пять миллилитров раствора тристина tetra hydro furan. После запечатывания флаконов поместите их в морозильную камеру при температуре отрицательные 20 градусов Цельсия на 20 минут.

Тем временем добавьте 1 125 микролитров раствора тетрагидрофурана ди изопропиламина два к одному в шприц r и s. Отдельно добавьте 356 микролитров 2 4 6 триметилпурина в каждый из флаконов, содержащих охлажденные бром-кислоты и фосгеновые смеси, дающие белые осадки. Сразу же нанесите соответствующую суспензию непосредственно на ифицированные бусины, а затем поместите их на шейкер для встряхивания при 120 оборотах в минуту в течение двух часов.

Для соединения бромоуксусной кислоты с диизопропилкарбодиамином добавьте пять миллилитров двухмолярного раствора бромоилуксусной кислоты диметилформамида в шприц В. После встряхивания добавьте пять миллилитров двухмолярного раствора дипропилкарбодиамина диметилформамида в тот же шприц и аккуратно встряхните после этого место шприц Б на том же шейкере, что и шприц р и с. Затем встряхивайте шприцы в течение двух часов, предварительно тщательно промыв шприцы дихлорметаном и диметилформамидом. Соберите все шарики из шприцев R, S и B в один 12-миллилитровый шприц-реактор.

После того, как шарики были промыты пять раз диметилформамидом, добавьте в шприц 10 миллилитров раствора дихлорметана диметилформамида один к одному. Разделите все шарики поровну на семь отдельных двухмиллилитровых шприцев с помощью пипетки объемом 1000 микролитров с усеченным наконечником пипетки для эманации, добавьте в соответствующий шприц пять миллилитров из семи заранее приготовленных двух молярных растворов амина. Инкубируйте все семь шприцев в инкубаторе с температурой 60 градусов Цельсия с встряхиванием в течение ночи после инкубации.

Вымойте бусины, которые нужно расщепить пять раз, дихлоралметаном. Встряхнув бусины в течение 15 минут и снова промыв их дихлорметаном, слейте дихлорметан из шприца. Затем переложите каждую отдельную бусину в 96-луночную пластину.

С помощью светового микроскопа и пипетки с усеченным наконечником накройте пластину 96 лунки крышкой и поместите ее в морозильную камеру с отрицательными температурами 20 градусов Цельсия на 15 минут. После того, как тарелка будет извлечена из морозильной камеры, добавьте 20 микролитров заранее приготовленного охлажденного раствора хлорметана TFA DI один к одному в каждую лунку, содержащую шарик. Установите на место крышку и поместите настенную пластину 96 на шейкер обратно в морозильную камеру с отрицательным температурой 20 градусов Цельсия.

Встряхнув в течение 20 минут, достаньте настенную пластину 96 из морозильной камеры и снимите крышку. Высушите феном дихлорметан из каждой лунки, обдувая его воздухом. При расщеплении при комнатной температуре с использованием 50% раствора ТФА DI хлорметана наблюдается значительная деградация.

Пики 593 и 484 соответствуют линкеру и тримеру ФТА соответственно, показывая, что вся молекула была успешно синтезирована на грануле, но деградировала во время расщепления. При расщеплении в условиях низких температур, как описано выше, количество деградации, вызванной ТЖК, значительно подавляется. Механизм расщепления был описан в предыдущей литературе, и считается, что он проходит через олайновый промежуточный продукт молекул ТФК может быть секвенирован Ms.MS, а картина фрагментации аналогична пептидам и пептидам.

Молекулы ЧФК, синтезированные с S-2, бромпропольной кислотой, D-4, обычно дают более широкие пики в МС и МСМ. Ms.Spectra из-за наличия продуктов неполного срока действия, таких как S два бромпропана, NOIC кислота D три, это может быть использовано в качестве указания на присутствие R хирального центра во время процедуры секвенирования, молекулы ТФК также имеют тенденцию образовывать больше аддукта, чем пептидный пептид. Поэтому предпочтение отдается воде с низким содержанием натрия и пластиковым аппаратам.

Еще одним потенциальным побочным продуктом является акриламид, образующийся в результате выведения брома во время аминирования. Как только акриламид образуется, последовательность прерывается. Эту проблему можно решить, снизив концентрацию первичного амина до одного моляра с целью уменьшения раствора.

Базичность После освоения библиотеки хорошего размера, ее можно подготовить за два дня, если все сделано правильно. Теперь, когда эта химия полностью разработана и синтез достаточно эффективен, я надеюсь, что другие исследователи возьмут на вооружение эту мощную технологию для создания конформационно ограниченных пептидных миметиков для разработки лекарств и зондов.