Стенограмма и метаболитов профилирования по оценке табака Дерево и тополя в качестве сырья для био-основанной промышленности

Общая цель данной процедуры заключается в получении и оптимизации данных секвенирования РНК и метаболомного профилирования из материала листьев табачного дерева для оценок в рамках системной биологии. Это достигается путем первоначального сбора биологического материала серии листьев на разных стадиях развития. Вторым этапом является экстракция материала с использованием соответствующих растворителей в зависимости от последующего анализа.

Далее с помощью газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС) измеряют содержание метаболитов и углеводородов, а транскрипты анализируют с использованием данных секвенирования РНК. В конечном итоге сочетание профилирования метаболитов и транскрипционного профилирования посредством секвенирования РНК используется для того, чтобы показать, как в листьях табачного дерева вырабатываются длинноцепочечные углеводороды и другие важные соединения. Данный метод может быть использован для идентификации и количественного определения важных полезных метаболитов, синтезируемых в листьях табачного дерева.

Хотя данный метод позволяет получить представление о метаболоме дерева табака, он также может быть использован для других систем, таких как табак или родственные виды. Как правило, специалисты, впервые применяющие этот метод, сталкиваются с трудностями, так как из листьев дерева табака сложно выделить качественную РНК.

В этом многокомпонентном видео Bioo PRO вы увидите, как участники группы FERNA проводят экстракцию и профилирование метаболитов. С помощью ГХ-МС вы также увидите, как участник группы Фрейзера экстрагирует углеводороды, а участник моей собственной группы — выделяет РНК для секвенирования РНК. Начните с выращивания растений Neko Oceana Glauca в горшках диаметром 30 см, содержащих профессиональный питательный субстрат M2, как подробно описано в текстовом протоколе. Для подготовки первичных метаболитов соберите листья и стебли растения и немедленно заморозьте материал. Лиофилизируйте замороженные растительные материалы путем сублимационной сушки в течение трех дней, затем измельчите лиофилизированные образцы в шаровой мельнице с металлическими шариками. Разлейте полученный мелкопомолотый сухой материал по центрифужным пробиркам объемом 2 мл или стеклянным флаконам. Затем отвесьте 10 мг измельченного сухого растительного материала листьев или 20 мг материала стеблей в пробирки с круглым дном и завинчивающейся крышкой объемом 2 мл.

Добавьте 1,4 milliliters 100% метанола и перемешайте на вортексе в течение 10 seconds. Затем, перед перемешиванием, добавьте 60 microliters rib atol в качестве внутреннего количественного стандарта. Добавьте один стальной шарик и гомогенизируйте материал в шаровой мельнице-миксере в течение двух minutes при частоте 25 hertz, после чего центрифугируйте образец в течение 10 minutes.

При центрифугировании с ускорением 11 000 ×g перенесите супернатант в стеклянный флакон. Добавьте 750 µL хлороформа и 1,5 mL воды, после чего перемешайте смесь на вортексе в течение 10 секунд. Затем перенесите 150 µL из верхней фазы в новую центрифужную пробирку объемом 1,5 mL.

Затем высушите образцы в вакуум-концентраторе. Крайне важно доводить образцы до полного высушивания в течение периода от 3 до 24 часов, пока не исчезнет вся остаточная жидкость. После высушивания добавьте 40 µL гидрохлорида метина.

Затем перемешайте смесь в горизонтальном термошейкере в течение двух часов при 37 °C. Добавьте 70 µL смеси M-S-T-F-A, после чего снова инкубируйте с перемешиванием в течение двух часов при 37 °C. Осадите капли на крышке с помощью короткого центрифугирования, прежде чем переносить жидкость в стеклянные виалы, подходящие для ГХ-МС анализа.

После ГХ-МС проанализируйте данные, настроив программное обеспечение для анализа данных масс-спектрометрии и выбрав набор данных для обработки. Подготовьте таблицу обнаруженных значимых пиков в соответствии с классом соединений. Идентифицируйте пики путем сопоставления со стандартными соединениями, после чего аннотируйте обнаруженные пики, используя масс-спектрометрический анализ, алгоритмы структурной характеристики, обзор литературы и поиск по базам данных метаболитов для экстракции углеводородов.

Погрузите примерно 200 milligrams свежесобранных листьев ncoa glauco в растворитель на период от двух до 20 минут, извлеките листья и полностью удалите растворители с помощью роторного испарения. Затем ресуспендируйте образцы в одном milliliter гексана степени чистоты HPLC. Выполните анализ образцов методом GCM s, используя параметры, подробно описанные в текстовом протоколе.

Сначала обработайте компоненты хроматограммы с помощью автоматизированной системы деконволюции и идентификации масс-спектров (MS.Deconvolution) и библиотеки масс-спектров NIST 98 MS.Library. Подтвердите идентификацию насыщенных длинноцепочечных алкановых углеводородов путем сравнения времен удерживания и классических паттернов фрагментации с известными подлинными стандартами. Затем количественно определите содержание углеводородов, сравнив интегрированные площади пиков с кривыми зависимости отклика от дозы.

На основе подлинных стандартов рассчитайте средние значения и стандартную ошибку среднего с помощью программного обеспечения Excel. Данный протокол сочетает экстракцию РНК с использованием TRIOL и набора RN easy для получения высококачественной РНК. Разотрите 100 milligrams замороженного растительного материала в центрифужных пробирках объемом два milliliter с металлическим шариком с помощью миксер-мельницы. После гомогенизации образца центрифугируйте материал в течение 10 minutes при 12, 000 ×g и четырех °C, затем добавьте один milliliter triol.

Перенесите супернатант в новую реакционную пробирку. Добавьте 200 µL хлороформа и несколько раз переверните пробирку перед инкубацией в течение трех минут при комнатной температуре. Затем центрифугируйте смесь в течение 15 минут.

Как и прежде, перенесите верхнюю водную фазу в новую реакционную пробирку. Добавьте примерно 2,5 объема этанола. Несколько раз переверните пробирку и инкубируйте в течение 30 минут при -80 °C.

Затем перенесите образец вместе с любым выпавшим осадком в спин-колонку. Центрифугируйте колонку в течение 15 секунд при 8 000 ×g и удалите фильтрат. Добавьте в спин-колонку 700 µL промывочного буфера RW1, входящего в комплект для экстракции, и центрифугируйте.

Снова, удалив фильтрат, добавьте в центрифужную колонку 500 µL второго промывочного буфера RPE, который также входит в набор. Снова центрифугируйте колонку и удалите фильтрат, после чего добавьте еще порцию буфера RPE и повторно центрифугируйте. Затем, как и прежде, поместите центрифужную колонку в новую реакционную пробирку объемом 1.5 mL, добавьте 50 µL воды, свободной от РНК, и центрифугируйте колонку в течение одной минуты при 8,000 ×g для элюции РНК.

Удалите остаточную ДНК с помощью набора для очистки от ДНК в соответствии с инструкциями производителя. В качестве заключительного этапа определите качество РНК. Перед отправкой РНК на секвенирование следующего поколения показатель целостности РНК (RIN) должен быть выше 8.

Профиль ВЭЖХ демонстрирует репрезентативный результат анализа изопреноидов в экстрактах листьев ncoa glauca. Различные ИЗОПРЕНОИДЫ с C 40 и выше были обнаружены с помощью фотодиодного матричного детектора. Пики были аннотированы на основе совместной хроматографии и спектрального сравнения с аутентичными стандартами.

Две масс-хроматограммы представляют собой результат анализа первичных метаболитов из листьев и стеблей ncoa, glauco. Также приведен масс-спектр пика, соответствующего серину; в качестве примера показан репрезентативный результат работы биоанализатора, использованного для определения качества РНК. Два основных пика на хроматограмме соответствуют 18 s и 25 s рибосомной РНК, что указывает на сохранность РНК в данном образце.

В случае частичной или сильной деградации РНК появятся дополнительные пики фрагментированной рибосомной РНК. После освоения данный метод можно выполнять быстро, и он совместим с последующим анализом других метаболитов. Для получения ответов на дополнительные вопросы, такие как синтез малых РНК или экспрессия специфических генов, можно использовать другие методы, например ПЦР в реальном времени или иные способы анализа РНК.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как извлекать и оценивать данные о метаболитах табачного дерева.