Au-Взаимодействие SLP1 Полимеры и монослоя от

Общая цель данного эксперимента заключается в изучении особенностей сорбции золота S-слойными белками представленного бактериального штамма с экологической и технологической точек зрения. Эти методы позволяют ответить на ключевые вопросы экологической науки в таких областях, как процессы сорбции, удаление и извлечение металлов. Основным преимуществом данных методов является возможность обнаружения сорбции металлов и адсорбции наночастиц в различных масштабных диапазонах.

С помощью QCM-D можно обнаружить это в ходе измерения в режиме реального времени. Для начала данной процедуры установите в жидкостные ячейки контрольные датчики (сенсорные заглушки). Прокачайте через систему QCM-D и трубки не менее 20 миллилитров на модуль 2% щелочного жидкого очищающего средства в ультрачистой воде.

После этого пропустите через систему ультрачистую воду в объеме, в пять раз превышающем объем одного модуля, со скоростью потока до 300 microliters per minute в соответствии с протоколом производителя. Очистите датчики из диоксида кремния вне потоковых модулей путем инкубации в 2% растворе sodium dodecyl sulfate в течение не менее 20 минут. Затем несколько раз промойте датчики ультрачистой водой.

После высушивания кристаллов отфильтрованным сжатым воздухом поместите их в камеру озоновой очистки на 20 минут. Затем повторите процедуру очистки дважды, чтобы удалить все органические загрязнения. Для удаления связанных металлов с поверхности сенсора промойте сенсоры 1 M азотной кислотой.

Затем несколько раз промойте сенсоры ультрачистой водой. Далее модифицируйте сенсоры путем нанесения попеременных слоев полиэтиленимина и полистиролсульфоната в концентрации 3 г/л методом погружения с использованием техники послойного нанесения (LBL). Поместите сенсоры в соответствующие растворы полиэлектролитов в глубокодонные планшеты и инкубируйте их в течение 10 минут при комнатной температуре.

Затем извлеките сенсоры из раствора полиэлектролита и тщательно промывайте их ультрачистой водой после каждого этапа нанесения покрытия методом окунания. По завершении внешней модификации поместите сенсоры в проточный модуль. Перед началом экспериментов уравновесьте сенсоры, промыв их ультрачистой водой.

На этом этапе растворите ранее выделенный и очищенный Slp1 в мочевинном растворе для перевода полимеров в мономеры. Центрифугируйте мономерные белки при 15,000 ×g и 4 °C в течение одного часа для удаления крупных белковых агрегатов. Смешайте супернатант растворенного и центрифугированного Slp1 с буфером для рекристаллизации до конечной концентрации белка 0.2 г/л.

После успешной рекристаллизации белка на поверхности модифицированных полиэлектролитом сенсоров внутри проточных модулей интенсивно промойте покрытые сенсоры буфером для рекристаллизации со скоростью потока 125 microliters per minute до достижения стабильных значений сдвигов частоты и диссипации. После успешного нанесения покрытия Slp1 в проточных модулях интенсивно промойте полученный слой Slp1 1.6 millimolar цитратным буфером pH 5.0 до достижения стабильных значений сдвигов частоты и диссипации. Затем подайте предварительно приготовленный one millimolar раствор наночастиц в проточные модули со скоростью потока 125 microliters per minute.

Затем отследите масс-адсорбцию на слой Slp1. После завершения взаимодействия с металлическими наночастицами промойте слой буфером без наночастиц, чтобы удалить слабосвязанные металлы или наночастицы. С помощью атомно-силового микроскопа (АСМ) с инвертированным оптическим микроскопом зарегистрируйте изображения в жидкой среде, используя ультрачистую воду, непосредственно на покрытых сенсорах QCM-D.

После проведения экспериментов QCM-D промойте сенсоры ультрачистой водой и поместите их в жидкостную ячейку AFM. Используйте кантилевер с резонансной частотой в воде приблизительно 25 килогерц и жесткостью менее 0.1 ньютона на метр. Установите скорость сканирования в диапазоне от 2.5 до 10 микрометров в секунду.

Получите изображения в динамическом контактном режиме, когда кантилевер возбуждается пьезоэлементом на своей резонансной частоте. В завершение определите расстояние от кантилевера до поверхности по затуханию колебаний. Максимальная металлсвязывающая способность золота 3 в суспензии Slp1 показывает, что оно стабильно связывалось в течение 24-часовой инкубации в исследуемом диапазоне pH.

Мгновенное снижение частоты указывает на быструю адсорбцию и высокое сродство белков к модифицированной полиэлектролитом поверхности. Диссипация также немедленно возрастает, что свидетельствует об адсорбции вязкоупругих молекул на поверхности, так как быстрое затухание приводит к увеличению значений диссипации. Пресинтезированные наночастицы золота инкубировали с Slp1 и анализировали методом SDS-PAGE, что подтвердило данные QCM-D, согласно которым наночастицы не нарушают структуру Slp1.

Адсорбция предварительно синтезированных наночастиц металлического золота с нулевым зарядом для экспериментов QCM-D представлена на графиках зависимости delta D от delta F, а также в виде профилей толщины и массы. Здесь показана белковая решетка Slp1, перекристаллизованная на сенсорах, модифицированных полиэлектролитом. Константа решетки была определена в пределах от 13 до 14 nanometers, а толщина слоя составила 10 ± 2 nanometers.

Исследования методом АСМ подтвердили, что после взаимодействия с золотом (III) решетка Slp1 осталась полностью неповрежденной, что подтверждает результаты QCM-D, предсказывавшие стабильность покрытия. АСМ подтверждает адсорбцию наночастиц золота (0) на решетке Slp1, однако из-за размера частиц они не следуют симметрии p4 структуры Slp1. После освоения данной методики процедура может быть выполнена в течение одного рабочего дня при условии ее правильного проведения.

После применения данных методов можно использовать другие техники, такие как инфракрасная спектроскопия или гелиевая ионная микроскопия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о конкретных сайтах связывания или взаимодействии с золотом или наночастицами золота. Представленный метод открыл путь для uzrachem в изучении взаимодействий биомолекул с металлами и, например, процессов адсорбции и десорбции на различных типах поверхностей. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как исследовать взаимодействие металлов с биологическими растворителями; пожалуйста, при использовании данного метода не забывайте надевать защитные очки, лабораторный халат и, конечно же, перчатки.