Пробоподготовка липидным монослойным методом для электронно-кристаллографических исследований
20 ноября 2021 г.
Липидные монослои использовались в качестве основы для формирования двумерных (2D) белковых кристаллов для структурных исследований на протяжении десятилетий. Они стабильны на границе раздела воздух-вода и могут служить тонким поддерживающей материалом для электронной визуализации. Здесь мы представляем проверенные этапы подготовки липидных монослоев для биологических исследований.
На протяжении многих лет липидные монослои использовались в качестве поддерживающего слоя для содействия 2D-кристаллизации белков периферических мембран, а также растворимых белков. Этот метод также может быть применен к 2D-кристаллизации, как некоторые интегральные мембранные белки. Но требуется более обширное эмпирическое исследование для определения моющих и диализных условий, способствующих разделению на липидный монослой.
На границе раздела воздушной воды образуется липидный монослой, так что полярные головные группы липидов остаются гидратированными в водной фазе. А неполярные ацильные хвосты липидного перегородки с воздушной водной границей раздела, что нарушает поверхностное натяжение и выравнивает водную гладь. Характер заряда отличительных химических фрагментов групп головок липидов обеспечивает сродство к белкам в растворе.
Содействие связыванию, и в принципе формированию 2D-массива. Любые 2D-кристаллы, образованные на липидном монослое, могут быть легко перенесены в электронный микроскоп на ЭМ-сетке с углеродным покрытием, которая используется для подъема и поддержки кристаллической решетки на липидном слое. В этой рукописи мы описали липидную монослойную методологию для криогенной электронной микроскопии.
Липидный монослойный препарат. Препарат липидного запаса, готовят 0,01 мг на мл липидной смеси в объеме 9:1 к объему хлороформа, метанола. Используют 8,91 мл хлороформа и 0,99 мл метанола и 0,1 мл 10 мг на мл липидного раствора.
Подготовка тефлоновой пластины. Обшивайте тефлоновую пластину ультразвуком в метаноловой ванне в течение пяти минут. Промыть горячей водой в течение 15 минут, а затем промыть дистиллированной водой.
Высушите тефлоновую пластину в высушиваемом в течение 30 минут и держите ее под вакуумом до использования. Образование липидного монослоя на буферном резервуаре. Расчетное время работы составит полтора часа.
Поместите фильтровальную бумагу типа один в чашку Петри и разложите тефлоновый блок поверх фильтровальной бумаги. Заполните колодцы тефлоновой плиты 60 микролитами буфера. Осторожно добавляйте жидкую смесь поверх буферной поверхности капля за каплей.
В идеале один микролитр на каплю с помощью шприца Гамильтона. Смочите фильтровальную бумагу дистиллированной водой и сохраните влажность в чашке Петри. Инкубировать при комнатной температуре в течение 60 минут, хлороформ должен испариться и на поверхности буферов должен образоваться монослой липидов.
Нанесение ЭМ сетки на липидный монослой. Расчетное время работы полтора часа. Аккуратно поместите ЭМ-сетку с углеродным покрытием без свечения, выбрасывая углерод стороной вниз на поверхность каждого буферного резервуара.
Осторожно вводите белки в боковую инъекционную скважину, используйте конечные концентрации белка в колодце вокруг одного микромоляра. Инкубировать 60 минут при комнатной температуре. Осторожно вводят примерно от 20 до 30 микролитров буфера в отверстие для впрыска, чтобы поднять сетку над поверхностью тефлонового блока.
Это позволяет подобрать сетку парой пинцетов и поднять ее вертикально с капельки. Репрезентативные результаты. Липидный монослой, нанесенный на электромагнитную сетку, может быть визуализирован под просвечивающим электронным микроскопом без контрастного окрашивания.
Монослойное присутствие может быть распознано по контрастной разнице с областью без какого-либо образца на этом лучевом пути. Области, которые имеют липидное монослойное покрытие, имеют более низкую контрастность, чем те, которые не имеют покрытия. Поскольку электронный пучок через пустые дыры не имеет рассеяния, он показывает более яркое освещение.
В заключение, липидный монослойный метод предлагает возможность изучения белковых структур благодаря своей простоте. Это может обеспечить альтернативный подход для облегчения процесса 2D-кристаллизации.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Липидные монослои служат стабильной основой для двухмерной кристаллизации белков, что облегчает проведение структурных исследований. Этот метод особенно полезен для периферических мембранных и растворимых белков, а при тщательной оптимизации может быть адаптирован и для интегральных мембранных белков.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биофизика
- Структурная биология
- Биохимия
Обзор
- Липидные монослои формируются на границе раздела воздух-вода.
- Полярные головные группы остаются гидратированными в водной фазе.
- Неполярные ацильные хвосты распределяются по границе раздела воздух-вода.
- Химическая природа головных групп липидов влияет на сродство белков.
Цель исследования
- Представить метод подготовки липидных монослоев.
- Обеспечить кристаллизацию различных белков.
- Улучшить структурные исследования за счет применения усовершенствованных методов визуализации.
Используемые методы
- Подготовка липидных монослоев на границе раздела воздух-вода.
- Оптимизация условий использования детергента и диализа.
- Эмпирическое исследование распределения белков.
- Методы электронной микроскопии для структурного анализа.
Основные результаты
- Липидные монослои эффективно способствуют кристаллизации белков.
- Специфические условия повышают сродство белков к монослою.
- Интегральные мембранные белки могут быть кристаллизованы при дополнительной оптимизации.
- Данный метод обеспечивает стабильную платформу для электронной визуализации.
Выводы
- Липидные монослои являются универсальным инструментом для структурной биологии.
- Они облегчают изучение как периферических, так и интегральных мембранных белков.
- Необходимы дальнейшие исследования для уточнения условий с целью получения оптимальных результатов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Методы создания липидных монослоев позволяют осуществлять контролируемую двумерную кристаллизацию белков, что способствует определению структуры мембранных и растворимых мишеней. Данный подход улучшает валидацию мишеней, предоставляя воспроизводимые платформы для биофизической характеристики, что снижает неопределенность на ранних этапах разработки лекарственных средств. Этот метод способствует снижению механистических рисков за счет получения структурных данных высокого разрешения, что позволяет обоснованно оптимизировать ведущие соединения и принимать решения по формированию портфеля препаратов.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет исследовать белково-липидные взаимодействия и конформационные состояния, имеющие значение для функции мишени.
- Практическая ценность: предоставляет стандартизированную систему для оценки стабильности мишени и ее способности к связыванию.
- Научная ценность: способствует функциональной валидации мишени, позволяя проводить структурный анализ в условиях, близких к нативным.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет создавать гомогенные упорядоченные белковые массивы, подходящие для проведения скрининга с высоким разрешением.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость подготовки образцов, что имеет решающее значение для согласованности результатов анализа между различными исследовательскими группами.
- Научная ценность: Позволяет получать количественные структурные данные, которые можно сопоставлять с данными функционального анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Предоставляет структурные сведения о мембранных белках-мишенях, помогая в понимании механизмов заболеваний.
- Практическая ценность: Позволяет создавать переносимые образцы, совместимые с последующими этапами криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ).
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов за счет установления связи между структурными особенностями и фармакологической активностью.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод липидного монослоя интегрируется в рабочие процессы раннего этапа поиска лекарств, обеспечивая валидацию мишеней и идентификацию соединений-лидеров посредством структурной характеристики.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез посредством структурной визуализации расположения и взаимодействий белков.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет получения однородных 2D-кристаллов для проведения воспроизводимых биофизических измерений.
- Аналитика: предоставляет данные визуализации высокого разрешения, которые позволяют сравнивать структурные состояния при различных условиях.
- Трансляционные исследования: связывает структурные результаты с доклиническим этапом путем выяснения механизмов воздействия на мишени.
- Корпоративное повторное использование: создает многофункциональную платформу для структурного скрининга нескольких белковых мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишени за счет прямого структурного наблюдения.
- Операционная ценность: улучшает воспроизводимость и стандартизацию подготовки образцов для структурных исследований.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет снижения структурной неопределенности при выборе мишени.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию с учетом рисков на основе валидированных структурных и функциональных данных.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы с липидами, очисткой белков и физико-химией межфазных границ.
- Зависит от наличия оборудования, совместимого с требованиями чистого помещения, такого как шприцы Hamilton и тефлоновые подложки.
- Необходима стандартизация состава буферов и времени инкубации между различными лабораториями.
- Требует учета особенностей адаптации для разных классов белков, в частности для интегральных мембранных белков.
- Ограничено необходимостью эмпирической оптимизации условий диализа и подбора детергентов для определенных мишеней.
